pAd-bFGF-GFP轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與脫細(xì)胞支架體外構(gòu)建組織工程韌帶的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 非常嚴(yán)重的韌帶損傷無(wú)法自行修復(fù)，往往需要韌帶的重建。但無(wú)論自體或異體的韌帶移植物及合成材料均不能取得滿意結(jié)果。組織工程學(xué)的興起為韌帶重建提供了一條新的途徑。組織工程學(xué)韌帶構(gòu)建包括建立韌帶形態(tài)的支架結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)種子細(xì)胞并在支架上生長(zhǎng)和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)原來(lái)的支架進(jìn)行改建，最終形成具有自我更新和修復(fù)能力的韌帶組織。脫細(xì)胞韌帶支架通過脫去細(xì)胞成分，基本消除了免疫源性，同時(shí)保留天然韌帶的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，生物力學(xué)性能未受影響。作為

2、一種天然支架材料受到廣泛關(guān)注。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalcells，BMSCs)是目前比較熱門的種子細(xì)胞，體外能快速擴(kuò)增。有實(shí)驗(yàn)表明堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)和分泌韌帶特異性細(xì)胞外基質(zhì)。通過轉(zhuǎn)基因治療基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入生長(zhǎng)因子基因并在體內(nèi)改良種子細(xì)胞及改變體內(nèi)微環(huán)境來(lái)促進(jìn)器官組織的形成，是目前組織工程中研究的熱點(diǎn)。本研究利用腺病毒載體將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)與

3、脫細(xì)胞韌帶支架復(fù)合培養(yǎng)共同構(gòu)建組織工程韌帶。
　　 方法：
　　 1.分離、培養(yǎng)兔BMSCs和韌帶成纖維細(xì)胞(ligamentfibroblast，LF)。并對(duì)BMSCs細(xì)胞進(jìn)行鑒定
　　 分別通過骨髓穿刺Ficoll密度梯度離心法和組織塊培養(yǎng)法分離兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和髕韌帶成纖維細(xì)胞。MTT法檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖活性。通過成骨，成軟骨，成脂肪細(xì)胞多向分化能力的測(cè)定來(lái)鑒定BMSCs。
　　 2.Gatewa

4、y技術(shù)構(gòu)建攜帶人bFGF基因的重組腺病毒載體(pAd-bFGF-GFP)
　　 構(gòu)建只需兩步：BP反應(yīng)構(gòu)建入門克隆，LR反應(yīng)創(chuàng)建表達(dá)克隆。表達(dá)克隆在293細(xì)胞包裝成目標(biāo)腺病毒。測(cè)定病毒滴度。擴(kuò)增腺病毒載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后realtimeRT-PCR及westernblot檢測(cè)bFGF的表達(dá)。
　　 3.pAd-bFGF-GFP轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后測(cè)定培養(yǎng)液中bFGF的表達(dá)和對(duì)細(xì)胞增值及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響及與韌帶成纖

5、維細(xì)胞的比較
　　 攜帶bFGF基因的腺病毒用不同MOI值來(lái)轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖來(lái)確定最佳MOI值。以最佳MOI值轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，ELISA檢測(cè)bFGF蛋白表達(dá)、分泌趨勢(shì)。將攜帶bFGF目的基因腺病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs(pAd-bFGF-GFEBMSCs)、LF，BMSCs，轉(zhuǎn)染空病毒的BMSCs(pAd-GFP-BMSCs)進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖比較。Rea

6、ltimeRT-PCR檢測(cè)bFGF對(duì)BMSCs表達(dá)CollagenⅠ和CollagenⅢ、波形蛋白(Vimentin)在mRNA水平的影響。
　　 4.韌帶脫細(xì)胞處理，并進(jìn)行組織學(xué)及生物力學(xué)檢測(cè)；
　　 1％DCA法進(jìn)行韌帶脫細(xì)胞處理。將pAd-bFGF-GFP-BMSCs，LF，BMSCs，pAd-GFP-BMSCs種植脫細(xì)胞韌帶支架，MTT法檢測(cè)種子細(xì)胞在脫細(xì)胞支架上的黏附、生長(zhǎng)、增殖情況。RealtimeRT-PC

7、R檢測(cè)種子細(xì)胞CollagenⅢ、CollagenⅠ和Vimentin蛋白mRNA水平的表達(dá)。組織學(xué)切片，冰凍切片和共聚焦顯微鏡觀察pAd-bFGF-GFP.BMSCs在支架的生長(zhǎng)分布情況。生物力學(xué)檢測(cè)體外復(fù)合培養(yǎng)對(duì)韌帶機(jī)械性能的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.分離培養(yǎng)的BMSCs與LF在大體形態(tài)學(xué)上相似，均表現(xiàn)為長(zhǎng)梭形、漩渦樣生長(zhǎng)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示BMSCs的增殖活性明顯優(yōu)于LF。BMSCs具有向成骨，成脂肪，成軟骨

8、多向分化能力。
　　 2.成功構(gòu)建了攜帶人bFGF基因的質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和基因測(cè)序表明成功合成和整合了人bFGF基因。用重組質(zhì)粒腺病毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組腺病毒pad.bFGF-GFP。通過在293細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增，我們得到了高滴度的病毒，滴度測(cè)定為(4.85×109ifu/ml)。realtimeRT-PCR及Western-blot證實(shí)目的基因bFGF在基因水平和蛋白水平高效表達(dá)。
　　 3.腺病毒對(duì)BM

9、SCs細(xì)胞有很高的轉(zhuǎn)染效率，MTT結(jié)果顯示MOI值為200時(shí)，BMSCs細(xì)胞具有最強(qiáng)的增值能力。ELISA檢測(cè)顯示：轉(zhuǎn)染后48hbFGF就已經(jīng)顯著表達(dá)，分泌高峰出現(xiàn)在第7天，此后逐漸下降，2周時(shí)仍檢測(cè)到。pAd-bFGF-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs與其他細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的細(xì)胞增值能力。培養(yǎng)2周后RealtimeRT-PCR檢測(cè)顯示CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA表達(dá)均顯著高于其他組。VimentinmRNA表達(dá)與LF相當(dāng)。

10、>　　 4.MTT法檢測(cè)顯示種子細(xì)胞與脫細(xì)胞支架復(fù)合培養(yǎng)后bFGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。RealtimePCR顯示pAd-bFGF-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs的CollagenⅢ、CollagenⅠ表達(dá)均顯著高于其他組。VimentinmRNA表達(dá)與成纖維細(xì)胞相當(dāng)。HE染色和冰凍切片共聚焦顯微鏡觀察pAd-bFGF-GFP-BMSCs在脫細(xì)胞韌帶纖維間生長(zhǎng)良好，呈梭形生長(zhǎng)。生物力學(xué)檢測(cè)顯示復(fù)合培養(yǎng)脫細(xì)胞韌帶與未培養(yǎng)韌

11、帶相比最大應(yīng)力沒有差別，彈性模量降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功分離培養(yǎng)獲得兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和韌帶成纖維細(xì)胞，并通過分化培養(yǎng)鑒定確認(rèn)獲得具有多向分化能力的BMSCs。成纖維細(xì)胞的獲取創(chuàng)傷較大。
　　 2.成功構(gòu)建了攜帶人bFGF基因的高滴度缺陷型重組腺病毒。
　　 3.轉(zhuǎn)染bFGF基因的BMSCs細(xì)胞能持續(xù)分泌bFGF至少兩周，具有很強(qiáng)的增值能力和表達(dá)韌帶特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白mRNA能力，優(yōu)于韌帶成