以細菌RNA聚合酶σ70為靶點的反義肽核酸的設(shè)計、合成及其抗菌作用研究.pdf

1、目的：
　　細菌耐藥已經(jīng)成為威脅人類健康的嚴重公共衛(wèi)生問題，尤其是對多種抗生素耐藥的“超級細菌”的出現(xiàn)，及其在全世界范圍內(nèi)的播散，使耐藥細菌感染成為臨床抗感染治療中極為棘手的問題。由于這些“超級細菌”對多種抗生素耐藥，可供治療選擇的抗生素十分有限，而且臨床上尚無特異性治療藥物，感染后患者死亡率很高，因此，“超級細菌”感染被列為世界上最難治療感染性疾患。面對“超級細菌”種類日趨增多和迅速蔓延，以及感染后致死率繼續(xù)攀高的嚴峻形勢，如何

2、有效控制“超級細菌”感染造成的危害已經(jīng)成為各國政府高度關(guān)注的焦點，尋找和研制有效控制“超級細菌”感染的新策略和新藥物，已成為當今世界各國科學家當務(wù)之急的研究目標。
　　經(jīng)典的抗生素研發(fā)重要策略之一是從已有各種類別抗生素中研發(fā)新的衍生物。伴隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來越多的細菌對現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生交叉耐藥，采用結(jié)構(gòu)修飾和改造研發(fā)新型抗生素受到限制，抗生素研發(fā)速度明顯減慢。而且新型抗生素應(yīng)用于臨床后，并不能從根本上避免細菌產(chǎn)生耐藥性，細菌很

3、快會對這些抗生素產(chǎn)生新的耐藥性。而且抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)速度已經(jīng)遠遠超過了研發(fā)新抗生素的速度，特別是多藥耐藥的“超級細菌”成為未來細菌耐藥新趨勢。
　　為了有效對抗日益嚴重的超級耐藥細菌，必須尋找新的突破口。反義抗菌劑突破以細菌蛋白為靶點的經(jīng)典研究思路，根據(jù)細菌體內(nèi)基因組學相關(guān)信息，以細菌體內(nèi)增值、致病性、耐藥相關(guān)基因為靶點，從阻斷相關(guān)基因的表達入手，進而達到抑制或殺滅細菌的作用，因而被認為是被對抗耐藥細菌的新策略和突破口。盡管已

4、有的研究已經(jīng)證實反義抗菌劑在抑制細菌靶基因方面顯示出可靠的靶基因抑制效果，良好的抗菌作用。但是仍有2個主要問題制約其向應(yīng)用的研發(fā)，其一，靶基因抑制過分專一，目前幾乎所有反義抗菌的研究主要集中在針對單一菌株的單一基因，因此僅對特定菌株產(chǎn)生作用，無法實現(xiàn)廣譜抗菌作用，進而限制其臨床應(yīng)用的潛在可能；其二，細胞攝入率低，反義分子的分子量較大，裸分子攝取進入細菌細胞內(nèi)的量極低。
　　針對上述問題，本課題確定以下2個研究目標：?尋找具有作為廣

5、譜反義抗菌劑潛在靶點的靶基因，并確定其有效性；?研究促進反義分子進入細菌的遞藥策略。基于上述目標，我們以當前臨床感染中最常見、耐藥發(fā)生率和耐藥強度最高的六種革蘭氏陰性致病菌,包括大腸埃希氏桿菌（Escherichiacoli,E.coli），腸炎沙門氏菌（Salmonellaenterica,SE）、肺炎克雷伯桿菌銅（Klebsiellapneumoniae,KP）、弗氏志賀菌（Shigellaflexneri,SF）、鮑曼氏不動桿菌（

6、Acinetobacterbaumanni,AB）及銅綠假單孢菌（Pseudomonasaeruginosa,PA）為研究對象，以上述細菌體內(nèi)共有的編碼RNA聚合酶?70因子的基因rpoD為靶點，設(shè)計并合成抗rpoD的肽核酸，將其與透膜肽（CPP）共價連接制備成反義抗rpoD因子肽核酸（anti-rpoDpPNA），在體外觀察其抗菌譜、抗菌活性、穩(wěn)定性，及其是否誘導(dǎo)細菌耐藥等效應(yīng)，在體內(nèi)觀察anti-rpoDpPNA對感染動物的保護效應(yīng)

7、。同時，與最先報道攜帶NDM-1耐藥基因超級細菌的實驗室合作，證實anti-rpoDpPNA抗超級細菌的有效性。
　　方法：
　　1.anti-rpoDpPNA的設(shè)計與合成
　　根據(jù)大腸埃希菌（E.coli），腸炎沙門氏菌（SE）、肺炎克雷伯桿菌銅（KP）、弗氏志賀菌（SF）、鮑曼氏不動桿菌（AB）和銅綠假單孢菌（PA）六種革蘭氏陰性細菌編碼RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的序列，采用BLAST軟件比對其序列確定同源

8、區(qū)域，并依據(jù)RNAstructure4.6軟件預(yù)測rpoDRNA二級結(jié)構(gòu)，確定反義結(jié)合可能靶序列，綜合多項參數(shù)（主要為結(jié)合能量參數(shù)、PNA解鏈溫度和靶RNA二級結(jié)構(gòu)）優(yōu)化設(shè)計抗rpoD的反義肽核酸（PNA），采用Fmoc方法在固相載體上自動合成抗rpoD反義PNA（anti-rpoDpPNA）以及作為對照的裸PNA、裸透膜肽（CPP）和錯配PNA-CPP結(jié)合物（mismatchedanti-rpoDpPNA），采用RP-HPLC對樣品進

9、行分離純化，MALDI-TOF測定純化后樣品的分子量。
　　2.anti-rpoDpPNA反義靶位有效性的體外篩選及最優(yōu)anti-rpoDpPNA的體外藥效學評價與穩(wěn)定性研究
　　選擇上述六種致病細菌的敏感菌株和多藥耐藥菌株為研究對象，以最低抑菌濃度（MIC）、細菌生長曲線、菌落形成單位（CFU）計數(shù)作為評價指標，對制備的系列anti-rpoDpPNA的抗菌活性和抗菌譜進行評價，篩選出具有最優(yōu)抗菌活性和最廣抗菌譜的anti-

10、rpoDpPNA，確定rpoD最敏感的反義抑制靶序列位置。
　　首次在《新英格蘭醫(yī)學雜志》和《柳葉刀-傳染病》對超級細菌耐藥基因NDM-1進行報道的Nordmann教授和Livemore教授的研究團隊，選取攜帶NDM-1基因的人類致病革蘭氏陰性細菌，主要包括大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼氏不動桿菌、陰溝腸桿菌（Enterobacterdoacae）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii），測定我們篩選到的最優(yōu)an

11、ti-rpoDpPNA各菌的MIC和MBC。
　　我們采用RT-PCR和WesternBlot方法，檢測最優(yōu)anti-rpoDpPNA對上述六種致病細菌rpoDmRNA和蛋白質(zhì)表達水平的影響，確證其反義抗菌作用的靶位特異性。進一步采用RT-PCR方法檢測最優(yōu)anti-rpoDpPNA對受大腸埃希菌rpoD調(diào)控的下游多個重要致病基因，包括seqA、ftsZ、mazF、prfB、rpoS、tufB和ygjD表達的影響，揭示最優(yōu)anti

12、-rpoDpPNA抗菌作用機制。
　　將最優(yōu)anti-rpoDpPNA與大鼠血漿共孵育，電泳法觀察anti-rpoDpPNA在大鼠血漿中的穩(wěn)定性；采用測定藥物對連續(xù)多代培養(yǎng)細菌MIC變化的方法，評估anti-rpoDpPNA誘導(dǎo)ESBLs-EC產(chǎn)生耐藥性的情況；建立人胃粘膜上皮細胞與單一（E.coliMG1655）或多種細菌（EC、SE和PA）共培養(yǎng)的感染模型，分別觀察不同濃度最優(yōu)anti-rpoDpPNA的廣譜殺菌作用及其對細胞

13、的保護作用。
　　3.最優(yōu)anti-rpoDpPNA體內(nèi)抗菌藥效學體內(nèi)抗菌藥效學研究
　　建立BALB/c小鼠的ESBLs-EC和MDR-SF膿毒血癥模型，觀察不同濃度anti-rpoDpPNA對BALB/c感染小鼠生存時間、存活率的影響；取感染小鼠的肝、脾、肺、腎，勻漿后將稀釋菌液涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基，觀察臟器中細菌菌落計數(shù)，以及最優(yōu)anti-rpoDpPNA對上述臟器內(nèi)ESBLs-EC和MDR-SF生長影響；取感染小鼠肝

14、、脾、肺、腎組織，HE染色，觀察最優(yōu)anti-rpoDPNA-CPP對感染組織形態(tài)學的影響。
　　結(jié)果：
　　1.anti-rpoDpPNA的優(yōu)化設(shè)計、合成與靶位篩選
　　應(yīng)用BLAST軟件對大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、弗氏志賀菌、鮑曼氏不動桿菌和銅綠假單孢菌等六種革蘭氏陰性細菌編碼RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD的序列進行同源性分析，結(jié)果顯示，上述細菌rpoD1.1區(qū)域的序列共享堿基序列最多，其中大

15、腸埃希菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌和弗氏志賀菌此區(qū)域序列相似性高達98％，可以作為廣譜反義PNA的靶基因部位。
　　RNAstructure軟件對rpoDmRNA1.1區(qū)域分析的結(jié)果顯示，該區(qū)域無明顯的穩(wěn)定雙鏈結(jié)構(gòu)，同時，采用12個堿基（最優(yōu)長度/效價比）為PNA設(shè)計的基本長度，結(jié)合Oligowalk和PNA的Tm軟件預(yù)測的參數(shù)，選取該區(qū)域的1-11、2-13、3-14、11-22、58-69位堿基序列作為合適的反義PNA靶序

16、列，并根據(jù)這些區(qū)域的核酸序列，分別設(shè)計并合成了5條與這些基因序列互補的抗rpoD反義PNA（anti-rpoDPNA），并分別在碳末端將其與促進PNA通過細胞壁的透膜肽(KFF)3K相連接，制備成抗rpoD的肽核酸-透膜肽接合物（anti-rpoDpPNAs）。采用RP-HPLC純化樣品，MALDI-TOF測定所有合成anti-rpoDpPNAs的實際分子量與理論分子量相符，純度大于90％。然后，在4株包括敏感和耐藥的大腸埃希菌上檢測a

17、nti-rpoDpPNA的抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作用于rpoDmRNA1-11和2-13序列區(qū)域的anti-rpoD-PNA-CPPs顯示良好的抑菌效果，其MIC值在25?M。該結(jié)果提示，基因rpoD的mRNA起始編碼子區(qū)域為PNA反義抑制作用的敏感部位，同時提示anti-rpoDpPNA對起始編碼子AUG的反義抑制是其發(fā)揮抑菌作用所必須的。
　　為了進一步增強anti-rpoD-PNA的反義抗菌效果與透膜效率，我們對作用于rpoD

18、mRNA1-12序列區(qū)的anti-rpoDpPNA進行了優(yōu)化設(shè)計，主要包括在PNA與CPP間加入甘氨酸，將CPP與anti-rpoDPNA氮端相連接，將anti-rpoDPNA碳末端2個核苷酸截去形成截短體，anti-rpoDPNA結(jié)合靶序列負向移位，以及將透膜肽(RXR)4XB與anti-rpoDPNA氮末端相連接等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別與(RXR)4XB和(KFF)3K連接的具有相同反義PNA序列，即anti-rpoDPNA01的截短體的P

19、NA0106和PNA0103顯示出良好的廣譜抑菌效果。anti-rpoDpPNA0106抑制敏感和多藥耐藥大腸埃希菌的MIC濃度為5～25?M，抑制多藥耐藥鮑曼不動桿菌、多藥耐藥弗氏志賀菌、多藥耐藥腸炎沙門氏菌、銅綠假單胞菌和產(chǎn)超廣譜?-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的MIC濃度分別為1.25、2.5、12.5、12.5和30?M。anti-rpoDpPNA0103抑制敏感和多藥耐藥大腸埃希菌的MIC濃度為6.25～25?M，抑制多藥耐藥鮑曼不動

20、桿菌、多藥耐藥弗氏志賀菌、多藥耐藥腸炎沙門氏菌、銅綠假單胞菌和產(chǎn)超廣譜?-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的MIC濃度分別為2.5、5、>25和40?M。
　　上述結(jié)果表明，rpoDmRNA可以作為廣譜反義抗菌的靶基因，該基因1.1區(qū)域內(nèi)的第1-10編碼區(qū)序列為理想的反義抗菌靶序列區(qū)，篩選獲得的反義PNA0103和PNA0106對多種革蘭氏陰性耐藥致病菌具有抑制作用，其抑菌效果較強。
　　2.anti-rpoDpPNA遞藥體系的篩選