熒光碳點(diǎn)的制備及其在藥物分析中的應(yīng)用.pdf

1、碳點(diǎn)(CarbonDots，CDs)作為新型熒光碳納米材料，具有類似量子點(diǎn)優(yōu)良的光致發(fā)光性能，同時(shí)具有化學(xué)惰性和良好的生物相容性。因此，碳點(diǎn)是潛在的可以替代量子點(diǎn)的良好選擇。然而，碳點(diǎn)的制備與應(yīng)用還有一定的挑戰(zhàn)，主要體現(xiàn)在以下兩方面:(1)高熒光量子產(chǎn)率的碳點(diǎn)，其發(fā)射光顏色大多為藍(lán)色或綠色，與生物體的背景熒光相近，不利于成像研究;而發(fā)射光為紅色的碳點(diǎn)，其熒光量子產(chǎn)率都較低。(2)由于碳點(diǎn)表面基團(tuán)的不確定性和缺乏多樣性，其應(yīng)用依然受到限制

2、。因此，如何充分利用熒光碳點(diǎn)的優(yōu)良性質(zhì)，將其應(yīng)用在更多的領(lǐng)域還需進(jìn)一步研究。本文主要從熒光碳點(diǎn)的制備出發(fā)，研究了其生物相容性，并最終將其應(yīng)用于藥物分析中。論文的主要內(nèi)容包括三個(gè)部分，概括如下：
　　第1部分:熒光碳點(diǎn)合成新方法研究。以血晶素為碳源，比較了煅燒和水熱法制備碳點(diǎn)的發(fā)光性質(zhì)，并最終采用水熱法一步合成熒光碳點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，血晶素的堿性水溶液在聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，250℃下反應(yīng)4h得到碳點(diǎn)，熒光量子產(chǎn)率達(dá)8.3％。合成的碳點(diǎn)不

3、僅具有良好的光致發(fā)光特性、還有較好的水溶性和光化學(xué)穩(wěn)定性。其形貌通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)表征，結(jié)果顯示所合成碳點(diǎn)為球形或類球形，粒徑分布在2-5nm，平均粒徑約為3.23nm;另外，碳點(diǎn)在水溶液狀態(tài)下的水合粒徑采用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)進(jìn)一步表征，約為10nm。Zeta電位分析表明碳點(diǎn)表面帶有負(fù)電荷。高分辨透射電鏡(HRTEM)成像顯示其具有完整的晶體結(jié)構(gòu)，晶格參數(shù)為0.22nm。X射線電子能譜與紅外光譜表征結(jié)果顯示碳點(diǎn)表面主要由C和

4、O兩種元素組成，帶有羥基和羧基官能團(tuán)。此外，該碳點(diǎn)具有良好的光致發(fā)光性能，激發(fā)與發(fā)射光譜較為對(duì)稱，其熒光發(fā)射隨激發(fā)波長(zhǎng)紅移而紅移且強(qiáng)度會(huì)發(fā)生變化，最大激發(fā)與發(fā)射分別在290nm和390nm。
　　第2部分:熒光碳點(diǎn)在藥物分析中的應(yīng)用。這一部分主要基于碳點(diǎn)熒光信號(hào)的改變檢測(cè)藥物，包括四個(gè)內(nèi)容:
　　1.基于小檗堿類猝滅CDs熒光檢測(cè)小檗堿類。小檗堿類是一類廣泛存在于自然界中的異奎寧生物堿，具有廣泛的藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)小檗堿類的

5、五種成分均可以猝滅CDs的熒光，且猝滅程度隨著小檗堿類濃度的增大而增大?；诖?，將CDs分別用于檢測(cè)這五種小檗堿類，并在優(yōu)化的條件下分別建立了線性關(guān)系。利用此種方法檢測(cè)鹽酸小檗堿片中的鹽酸小檗堿含量，結(jié)果與標(biāo)示量一致。對(duì)猝滅機(jī)理進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CDs的熒光發(fā)射與五種小檗堿類的吸收均有重疊，猝滅是因?yàn)镃Ds與它們發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。同時(shí)由于反應(yīng)前后CDs熒光量子產(chǎn)率沒有發(fā)生變化，說(shuō)明CDs與小檗堿類藥物之間發(fā)生了輻射能量轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致CDs熒光的猝滅

6、。
　　2.基于藥根堿致CDs發(fā)射紅移檢測(cè)藥根堿。研究發(fā)現(xiàn)，藥根堿在堿性條件下使CDs發(fā)射峰紅移，且紅移程度隨著藥根堿濃度增大而增大。藥根堿濃度在2.30μM到414μM范圍內(nèi)，位移值與濃度對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，方程式:Δλem=17.3logc-6.64(μM)，r=0.995(n=10)。藥根堿致CDs發(fā)射紅移的機(jī)理同樣是基于輻射能量轉(zhuǎn)移，主要是由于藥根堿的羥基在堿性條件下解離，導(dǎo)致吸收發(fā)生變化，與CDs的熒光發(fā)射重疊部分發(fā)

7、生變化，不同波長(zhǎng)處猝滅程度不同，于是發(fā)射峰紅移。
　　3.基于支鏈聚乙烯亞胺鈍化的碳點(diǎn)（PEI-CDs，參考文獻(xiàn)制備）熒光恢復(fù)檢測(cè)乙酰半胱氨酸。因?yàn)殂~離子能與PEI-CDs表面鈍化劑上的氨基發(fā)生配位作用，從而猝滅其熒光。但如果有乙酰半胱氨酸存在，其結(jié)構(gòu)上的巰基能與銅離子作用將Cu2+還原為Cu+同時(shí)自身形成二硫鍵，從而破壞了Cu2+與PEI-CDs表面氨基之間的作用，使得PEI-CDs熒光恢復(fù)，以此建立了PEI-CDs免標(biāo)記快速、

8、靈敏檢測(cè)乙酰半胱氨酸的方法。在優(yōu)化條件下，熒光恢復(fù)效率與乙酰半胱氨酸濃度在5.56μM～277.8μM范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為:I/I0=0.88+0.013c（μM），r=0.997(n=10)。
　　4.在PEI-CDs表面偶聯(lián)上FITC，基于熒光比率法檢測(cè)pH。通過(guò)熒光光譜表征證明PEI-CDs上偶聯(lián)了FITC。在pH6.4-7.2范圍內(nèi)對(duì)pH有響應(yīng)，線性方程如下:I520/I450=0.550+0.0252pH,

9、r=0.986。
　　第3部分:CDs生物相容性的研究。首先，研究了血晶素制備的CDs及支鏈聚乙烯亞胺鈍化的碳點(diǎn)（PEI-CDs，根據(jù)文獻(xiàn)制備）和CTAB-CDs（本實(shí)驗(yàn)室以富勒烯為碳源，CTAB為鈍化劑制備）的細(xì)胞毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)由血晶素制備的羥基碳點(diǎn)濃度高達(dá)5mg/mL時(shí)也不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成明顯毒性;但PEI-CDs濃度大于2mg/mL可見明顯的細(xì)胞毒性，且細(xì)胞存活率比同濃度PEI存在時(shí)低，這是由于在PEI-CDs制備過(guò)程中有受熱，

10、可能導(dǎo)致PEI進(jìn)一步聚合從而增大了其毒性;CTAB作為陽(yáng)離子表面活性劑，其細(xì)胞毒性為眾人所知，CTAB-CDs的毒性相對(duì)最強(qiáng)，達(dá)到0.003mg/mL細(xì)胞存活率即降低至30％。說(shuō)明碳點(diǎn)本身細(xì)胞毒性很低，其細(xì)胞毒性最終取決于CDs表面鈍化劑的毒性作用。另外以斑馬魚和豆芽為模式生物，考察了CDs和PEI-CDs對(duì)于動(dòng)植物活體生物生長(zhǎng)的影響。在0.05mg/mLCDs和PEI-CDs溶液中，均未發(fā)現(xiàn)有斑馬魚胚胎孵化延遲效應(yīng)和胚胎發(fā)育畸形;通過(guò)

11、數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在0.05mg/mLCDs和PEI-CDs溶液中斑馬魚仔魚死亡率與對(duì)照組沒有明顯差異。CDs濃度小于0.005mg/mL時(shí)不會(huì)對(duì)豆芽的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的阻礙，而濃度為20mg/mL時(shí)培養(yǎng)的豆芽根莖長(zhǎng)則與對(duì)照組有明顯差異。PEI-CDs濃度小于0.05mg/mL沒有明顯差異，大于0.2mg/mL則培養(yǎng)的豆芽根莖長(zhǎng)與對(duì)照組有明顯的差異。這些結(jié)果說(shuō)明，碳點(diǎn)本身具有良好的生物相容性，其毒性最終取決于CDs表面鈍化劑的毒性強(qiáng)弱。