竹蓀中抑菌物質(zhì)的提取方法優(yōu)化及其抑菌機理的初步探究.pdf

1、竹蓀是一種常見真菌,長期以來作為典型的功能性食品而存在。目前分布在我國的竹蓀主要有7種,其中長裙竹蓀與棘托竹蓀都具有很強的食藥用價值,已在我國西南地區(qū)得到廣泛栽培。隨著國內(nèi)對天然產(chǎn)物研究的興起,對竹蓀的生物活性、功能成分、營養(yǎng)價值等的研究現(xiàn)已成為當(dāng)前科研領(lǐng)域研究的熱點。
　　本研究是上海市教委創(chuàng)新項目“竹蓀抑菌活性物質(zhì)的提取及其抑菌作用的研究(11YZ159)”中的一部分。主要以竹蓀子實體為原料,通過超臨界CO2萃取技術(shù)對抑菌物質(zhì)

2、的提取方法進(jìn)行優(yōu)化,以微量肉湯稀釋法對竹蓀通過多類提取方法所得物質(zhì)的抑菌效果作系統(tǒng)測定,同時進(jìn)行比較分析,并對竹蓀提取物的抑菌機理和應(yīng)用作初步研究。
　　首先,選擇單增李斯特菌,金黃色葡萄球菌,副溶血性弧菌,大腸桿菌,熒光假單胞菌,植物乳桿菌作為供試菌種,通過微量肉湯稀釋法測定四種提取方法提取棘托竹蓀和長裙竹蓀所得物質(zhì)的最小抑菌濃度,并將各提取方法的效果加以比較,篩選出抑菌效果最佳的提取方法。同時,將微量肉湯稀釋法與平板計數(shù)結(jié)果進(jìn)

3、行比較,對其測定結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評估。實驗結(jié)果表明:棘托竹蓀與長裙竹蓀通過的四種提取方法所得的物質(zhì)均具有抑菌作用,其中,水蒸氣蒸餾法所得揮發(fā)油的抑菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于三種有機溶劑提取物,其MIC值為31.2mg/mL,而通過有機溶劑提取所得的抑菌物質(zhì)的最低MIC值僅為39.0mg/mL。棘托竹蓀水蒸氣蒸餾法所得揮發(fā)油對革蘭氏陰性菌的抑制效果要普遍優(yōu)于革蘭氏陽性菌。而長裙竹蓀同種方法所得的產(chǎn)物對陽性菌的抑制效果要優(yōu)于陰性菌。微量肉湯稀釋法與平板計

4、數(shù)結(jié)果所測得的MIC值對比,重合度達(dá)91.7％,證明其具有較高的準(zhǔn)確性。
　　其次,設(shè)計 L16(43)正交實驗,通過超臨界 CO2萃取裝置對竹蓀中的活性物質(zhì)進(jìn)行萃取,以提取所得物質(zhì)對單增李斯特菌和副溶血性弧菌的抑菌率為衡量抑菌效果指標(biāo),設(shè)計竹蓀抑菌物質(zhì)提取的新方法。研究結(jié)果表明:超臨界 CO2萃取所得的物質(zhì)對單增李斯特菌、副溶血性弧菌均有抑制作用。棘托竹蓀在萃取壓力為20MPa,溫度為35℃,時間為120min的條件下,所得提取

5、物質(zhì)濃度在15.0mg/mL時,對單增李斯特菌、副溶血性弧菌在處理后24h的抑菌率分達(dá)85.7%與98.2%。并將棘托竹蓀揮發(fā)油與超臨界 CO2提取物的抑菌活性進(jìn)行了比較,確定了超臨界 CO2提取物的抑菌活性更強。
　　隨后,通過電鏡觀察超微結(jié)構(gòu),以及研究相關(guān)基因表達(dá)量的變化,初步探究竹蓀提取物的抑菌機理。實驗先提取了單增李斯特菌和副溶血性弧菌的總RNA,并通過反轉(zhuǎn)錄過程得到cDNA。然后選擇相關(guān)基因,合成引物,進(jìn)行Real-ti

6、me PCR。兩種供試菌均以本菌的16S rRNA作為內(nèi)參基因,所選單增李斯特菌的特征基因為prfA,iap,actA;而副溶血性弧菌的特征基因為nusA,tolC,fla,atpA,ef-Tu,fadL, dld。結(jié)果表明:從掃描電鏡(SEM)的觀察結(jié)果來看,在竹蓀提取物處理之后,單增李斯特菌和副溶血性弧菌的菌體都大大減少,單增李斯特菌的細(xì)胞出現(xiàn)變形,副溶血性弧菌的細(xì)胞膜破裂,內(nèi)容物被釋放出來。透射電鏡(TEM)的觀察結(jié)果證實了SEM

7、的結(jié)論,并展示了細(xì)胞內(nèi)容物逐步釋放的過程。而對相關(guān)基因相對表達(dá)量總體變化情況和不同時間點的變化情況的研究結(jié)果則表明:處理過后,單增李斯特菌的轉(zhuǎn)錄激活因子prfA其表達(dá)量趨勢由上調(diào)轉(zhuǎn)為下調(diào),說明提取物能夠在轉(zhuǎn)錄階段對單增李斯特菌的生命活動構(gòu)成影響。而副溶血性弧菌在處理過后,較對照組相比,tolC,atpA,dld表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào),fadL的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào),證明副溶血性弧菌對竹蓀提取物并無明顯的抗性,而nusA表達(dá)量的上調(diào)和ef-Tu表達(dá)量的