鳙魚中多聚磷酸鹽水解機(jī)理及無磷保水劑的研究.pdf

1、本文針對(duì)多聚磷酸鹽在水產(chǎn)品中檢測(cè)及水解等問題進(jìn)行了研究，以鳙魚為對(duì)象，建立了水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的測(cè)定方法，分離純化了焦磷酸鹽水解酶和三聚磷酸鹽水解酶，闡明了多聚磷酸鹽水解機(jī)理和保水機(jī)理，并開發(fā)了安全高效的磷酸鹽替代品。結(jié)論分述如下： 1。建立了水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽測(cè)定的離子色譜法。利用Dionex ICS 2000型離子色譜，Asll.Hc型陰離子分離柱，以氫氧化鉀為淋洗液，采取程序梯度洗脫可以對(duì)單磷酸鹽(Pi)、焦磷酸鹽(PP)

2、、三聚磷酸鹽(TPP)、六偏磷酸鹽(HMP)、腺苷二磷酸(ADP)和腺苷三磷酸(ATP)進(jìn)行定性定量分析。Pi、PP、TPP在0.005-0.5mmol/L的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r<'2>＞0.999，HMP相關(guān)系數(shù)r<'2>＞0.99。采用三氯乙酸超聲波萃取，在鳙魚肉中的回收率為99-111％，能夠用以測(cè)定鳙魚和其它水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽。 2.對(duì)不同水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的水解規(guī)律進(jìn)行了研究。使用本文建立的離子色譜

3、法可以準(zhǔn)確地測(cè)定TSPP和STPP在不同水產(chǎn)中的水解。STPP水解分為兩步，首先被水解成PP和Pi，其次生成的PP被進(jìn)一步水解成Pi。而添加的TSPP直接被水解成單磷酸鹽。TSPP和STPP中間水解產(chǎn)物PP的水解消弱了其提高肌肉保水性的功能特性。 3.本方法利用Dionex ICS 2000型離子色譜，ASll-HC型陰離子分離柱，以氫氧化鉀為淋洗液，采取程序梯度洗脫可以非常準(zhǔn)確地測(cè)定腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)和

4、Pi。ATP、ADP和Pi在0.01-0.1mmol/L測(cè)量濃度范圍內(nèi)與電導(dǎo)值具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.997。在此基礎(chǔ)上建立了魚肉Ca-ATPase活性的離子色譜測(cè)定法，為ATPase的研究提供了新的方法。 4.對(duì)鳙魚焦磷酸鹽水解酶(PPase)進(jìn)行了分離純化和生化特性的研究。肌肉通過0.05 mol/L KCl-20 mmol/L tris-HCl(pH7.0)緩沖液漂洗得到的粗酶液，經(jīng)過50％～80％(NH<,

5、4>)<,2>SO<,4>飽和度分段鹽析，50℃加熱處理，經(jīng)DE52陰離子交換線性洗脫層析，再經(jīng)Sephacryl S-300凝膠層析可以得到在native PAGE和SDS-PAGE圖譜上呈現(xiàn)單一蛋白條帶的純化酶。純化倍數(shù)為114.5倍，酶活回收率為4.5％。鳙魚中的PPase的相對(duì)分子量為50kDa，是有兩個(gè)相同的分子量為25kDa的亞基構(gòu)成，最適溫度和pH分別為50℃和8.0，該酶的熱穩(wěn)定性不強(qiáng)，在pH5.0-10.的范圍內(nèi)有著很

6、好的穩(wěn)定性。Mg<'2+>是該酶的必需離子，當(dāng)Mg<'2+>濃度與底物濃度比值≥1時(shí)，酶活性較高且保持穩(wěn)定。但當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂贛g<'2+>濃度時(shí)，底物對(duì)酶活性有一定的抑制作用。Co<'2+>和Mn<'2+>對(duì)。PPase也有一定的激活作用。低濃度的EDTA可以激活酶，而高濃度的EDTA卻能強(qiáng)烈抑制酶活。PPase酶可能為金屬蛋白酶。DTT可以增強(qiáng)酶活性。而檸檬酸鈉和亞硫酸氫鈉可以強(qiáng)烈抑制酶活。絲氨酸蛋白酶的特異性抑制劑PMSF可以完全抑

7、制酶活性，該酶可能為絲氨酸蛋白酶。在5mmol/L Mg<'2+>濃度下，PPase水解焦磷酸四鈉的Km為1.98mmol/L。 5.通過逐層剖析法證明了肌球蛋白頭部S-1具有TPPase活性，并闡明了鳙魚肌球蛋白頭部S-1 TPPase的生化特性。 純化的鳙魚TPPase水解Tpp的最適溫度為30℃。TPPase在30℃下比較穩(wěn)定，在保溫60min后仍具有較高的活性，但隨溫度升高穩(wěn)定性下降，在70℃下迅速失活。TPPa

8、se最適pH值為5.0和8.0，在中性偏酸的環(huán)境中較穩(wěn)定。TPPase活性受到Mg<'2+>的影響，在低于17mmol/L濃度下，TPPase活性隨Mg<'2+>濃度升高而升高，但高濃度的Mg<'2+>對(duì)TPPase卻起到了抑制作用。KCl對(duì)TPPase活性有一定的影響，當(dāng)濃度由0.1 mol/L提高到0.3mol/L 時(shí)TPPase活性迅速升高，但是當(dāng)KCI濃度進(jìn)一步升高時(shí)，酶活性趨于穩(wěn)定不再發(fā)生變化。EDTA-Na<,2>能顯著抑制

9、TPPase活力，而：Mg<'2+>可以緩解這種抑制作用。TPPase對(duì)于氧化劑和還原劑都比較穩(wěn)定。在0.3 mol/L KCl、5mmol/L Mg<'2+>和pH 8.0反應(yīng)體系條件下測(cè)定鳙魚TPPase的米氏常數(shù)為3.2mmol/L。 6.研究了三種多聚磷酸鹽對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響，探討了提高保水性的機(jī)理。氯化鈉在高離子強(qiáng)度下能夠破壞鳙魚肌原纖維結(jié)構(gòu)，使肌原纖維小片化并溶解。提出了焦磷酸鹽提高保水性的機(jī)理為：一，通過提高

10、蛋白靜電斥力，使肌原纖維橫向膨脹，增加肌原纖維內(nèi)部的空間；二，從A帶兩端提取蛋白，破壞肌動(dòng)蛋白和Z盤的連接，增加I帶空間；三，從H帶提取蛋白，破壞肌球蛋白桿部連接，增加A帶內(nèi)部空間；四，高濃度下能從整個(gè)A帶中提取蛋白，破壞肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的連接，粗絲和細(xì)絲分離，肌原纖維小片化，促進(jìn)肌原纖維蛋白的溶解，提高可溶性蛋白含量。三聚磷酸鹽作用途徑與焦磷酸鹽類似，一方面通過靜電斥力使肌原纖維橫向膨脹；另一方面提高離子強(qiáng)度增加蛋白質(zhì)的溶解；第三方

11、面是通過三聚磷酸鹽水解酶水解成焦磷酸鹽，然后以焦磷酸鹽形式發(fā)揮作用。焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽高能化學(xué)鍵的水解會(huì)釋放能量可能會(huì)解離肌動(dòng)球蛋白，影響肌原纖維結(jié)構(gòu)。六偏磷酸鹽對(duì)肌原纖維結(jié)構(gòu)不具備強(qiáng)烈的融脹破壞作用，而是使肌原纖維收縮變細(xì)，內(nèi)部空間大大減少，造成水分大量流失。在生產(chǎn)中使用的復(fù)合磷酸鹽常含有六偏磷酸鹽，其主要作用可能是螯合金屬離子，影響三聚磷酸鹽水解酶和焦磷酸鹽水解酶活性，進(jìn)而影響三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽的作用。 7．對(duì)磷酸鹽替代

12、物進(jìn)行了研究。利用化學(xué)法獲得的分子量大于6kDa的褐藻酸鈉裂解物HDX-A可以有效的增加南美白對(duì)蝦蝦仁的浸泡增重效果。在1％的浸泡液中處理1h，增重率可達(dá)到13％左右；HDX-A可以顯著保持冷凍蝦仁浸泡增重效果，防止了解凍損失，降低了蒸煮損失，保持了蝦仁的鮮嫩。在南美白對(duì)蝦冷凍蝦仁應(yīng)用效果優(yōu)于B542復(fù)合磷酸鹽。提出HDX-A提高冷凍蝦仁的保水性的可能機(jī)理為： 一，通過滲透作用進(jìn)入到蝦仁內(nèi)部，利用自身膨脹增加了肌束之間和肌原纖維