CA125升高患者的良惡性鑒別方法研究.pdf

1、癌抗原125(cancer antigen125，CA125)是婦科最常用的血清腫瘤標(biāo)志物。約80％的上皮性卵巢癌患者血清CA125水平升高。血清CA125水平能夠很好的反應(yīng)機(jī)體腫瘤負(fù)荷，因此是卵巢癌治療后的主要監(jiān)測隨訪指標(biāo)。但除了卵巢癌，血清CA125水平在許多其他良惡性疾病中也會異常升高。約1％的健康女性、6％的婦科良性疾病患者會出現(xiàn)血清CA125水平的升高。有研究者對一綜合醫(yī)療中心的血清CA125水平大于65U/ml的患者進(jìn)行分析

2、，發(fā)現(xiàn)74.3％的患者是婦科惡性腫瘤患者，10.2％為非婦科惡性腫瘤患者，另外13.1％為良性疾病患者，因此，CA125升高意義不明經(jīng)常導(dǎo)致患者的診療方案制定困難，并且給良性疾病患者帶來不必要的精神負(fù)擔(dān)。如果能找出良性來源和惡性來源CA125分子結(jié)構(gòu)之間的差異將能夠?qū)A125分子進(jìn)行分型，從而提高其診斷準(zhǔn)確性。
　　 目前對CA125分子結(jié)構(gòu)的了解已經(jīng)比較清晰。CA125是一種高度糖基化的粘蛋白。糖鏈部分約占整個分子質(zhì)量的20

3、％-70％。CA125分子經(jīng)酶切從細(xì)胞膜表面脫落進(jìn)入體腔或入血，成為游離CA125。CA125在成人組織中分布包括，苗勒氏管上皮，即輸卵管內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜(包括增生期、分泌期和孕期)以及宮頸內(nèi)膜；腹膜、胸膜以及心包膜等間皮組織；支氣管上皮，支氣管粘膜下腺；以及角膜和結(jié)膜上皮。正常情況下，血清CA125由這些組織合成脫落入血而形成，并處于低水平。在卵巢癌患者中，癌組織能夠表達(dá)高水平的CA125，并且組織表達(dá)水平與血清水平呈正相關(guān)。因此，我們

4、推測卵巢癌患者血清中的CA125主要來源于癌組織。而在良性疾病情況下，CA125主要由腹膜、胸膜等間皮組織以及女性生殖器官粘膜等非惡性組織合成。因此，良惡性疾病中CA125具有不同性質(zhì)的來源。
　　 大量研究證明，惡性腫瘤常伴隨著糖鏈合成、降解以及連接相關(guān)分子的異常改變，從而導(dǎo)致蛋白的異常糖基化狀態(tài)。例如，肝癌中AFP的核心巖藻糖修飾增加，因此檢測核心巖藻糖修飾的AFP所占的比例能夠區(qū)分肝癌和慢性肝硬化，提高肝癌的早期診斷率。目

5、前在卵巢癌中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種糖基化修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)異常，如漿液性卵巢癌中唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gal-Ⅲ、ST3Gal-Ⅳ和ST3Gal-Ⅵ表達(dá)下調(diào)，而ST3Gal-Ⅰ和ST6Gal-Ⅰ表達(dá)上調(diào)；黏液性卵巢癌中N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶GnT-Ⅴ表達(dá)上調(diào)。另外，卵巢癌組織中多種糖蛋白的糖基化狀態(tài)改變也被證實。
　　 因此，我們推測惡性來源的CA125與其他良性疾病或生理狀況下的CA125存在不同的糖基化狀態(tài)，并且這一糖基化差異能夠被用于C

6、A125的進(jìn)一步分類，從而鑒別良惡性CA125升高患者。
　　 雖然人們很早就認(rèn)識到糖鏈結(jié)構(gòu)生物學(xué)意義的重要性，但由于糖鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和檢測技術(shù)的限制，使得對其含義的解讀一直滯后于基因和蛋白質(zhì)。目前對糖鏈結(jié)構(gòu)的分析主要基于質(zhì)譜技術(shù)和以凝集素為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。兩種方法各有利弊。質(zhì)譜技術(shù)是基于分子碎裂片段的質(zhì)荷比對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測。它能夠得到蛋白質(zhì)的氨基酸序列、糖鏈組成以及糖基化位點等信息。但質(zhì)譜分析不適合于分析含量低，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的

7、分子。另外質(zhì)譜分析對儀器、分析人員水平有很高的要求，常規(guī)實驗室很難達(dá)到。凝集素分析技術(shù)是利用凝集素與特異糖鏈結(jié)構(gòu)的結(jié)合以達(dá)到糖鏈結(jié)構(gòu)及其含量推測的目的。由于凝集素與糖抗原的結(jié)合類似于抗原抗體反應(yīng)，因此它所識別的糖鏈結(jié)構(gòu)大多位于分子表面。這些結(jié)構(gòu)也恰好是糖鏈參與免疫識別等生物識別的關(guān)鍵位點，所以對生物功能分析更有意義。凝集素對于糖鏈的空間構(gòu)型、連接方式都有一定專一性，因此所得糖鏈空間結(jié)構(gòu)信息更精細(xì)。但凝集素技術(shù)所得到的信息只是此種糖抗原的

8、含量，而無法得到其定位等信息，因此在修飾位點分析方面弱于質(zhì)譜分析。除此之外，凝集素相關(guān)技術(shù)的檢測技術(shù)難度較低，易于在普通實驗室開展。
　　 本研究擬建立適于CA125糖基化狀態(tài)檢測的抗體.凝集素ELISA法，對血清CA125水平升高的婦科良惡性疾病患者CA125糖基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，尋找惡性腫瘤特異性CA125糖鏈結(jié)構(gòu)，評價其用于鑒別良惡性CA125升高的能力。
　　 第一部分旨在建立適于CA125糖基化狀態(tài)檢測的抗體-凝

9、集素ELISA法?？贵w一凝集素ELISA法是通過包被抗體捕獲樣品中的抗原，繼而利用凝集素對抗原表面糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測。由于抗體本身有糖基化修飾，因此我們首先利用高碘酸鈉對抗體糖鏈進(jìn)行氧化，繼而對其衍生化，達(dá)到封閉抗體糖鏈的目的。封閉后抗體上的大部分凝集素識別糖鏈信號被清除，使檢測背景信號明顯降低。為證明凝集素是通過識別CA125表面糖鏈產(chǎn)生的顯色信號，我們首先通過單糖抑制試驗證明顯色信號是由凝集素對糖鏈的識別產(chǎn)生的，之后我們通過梯度摻入C

10、A125證明顯色信號強(qiáng)度與CA125含量是呈正相關(guān)的。最終確定5種凝集素：BPL、PNA、SBA、UEA、VVA能夠用于建立抗體-凝集素ELISA法。
　　 第二部分旨在使用已建立的抗體-凝集素ELISA法檢測血清CA125升高的婦科良惡性疾病患者其CA125糖基化狀態(tài)，尋找惡性腫瘤特異性CA125糖鏈結(jié)構(gòu)，評價其用于鑒別良惡性CA125升高的能力。使用第一部分篩選出的五種抗體-凝集素ELISA法檢測血清CA125糖基化水平，結(jié)

11、果五種凝集素所識別糖鏈結(jié)構(gòu)在惡性腫瘤來源的CA125中都呈高表達(dá)，其中VVA所識別的Tn抗原在兩組間差異最明顯。因此，我們構(gòu)建了以CA125抗體X325為包被抗體，識別Tn抗原VVA為檢測凝集素的抗體.凝集素ELISA法(簡稱為CA125/Tn ELISA)，用于鑒別良惡性CA125升高患者。首先，我們使用對91例血清CA125水平大于35U/ml的患者進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，CA125/Tn ELISA用于診斷惡性腫瘤來源CA125的AU