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文檔簡介
1、目的:復(fù)合蛇毒(composite snake venom,CSV)是由多種具有抗腫瘤作用的蛇毒按照一定比例混合所得的制劑。本課題以中藥學血清藥理學的實驗方法,研究口服復(fù)合蛇毒小鼠血清(S-CSV)的腫瘤抑制作用,旨在對蛇毒制劑口服給藥提供一定的實驗依據(jù)。
方法:⑴經(jīng)過預(yù)實驗,測定小鼠口服復(fù)合蛇毒的百分之零死亡的最大劑量(LD0)為68mg/kg,百分之百死亡的最小劑量(LD100)為500mg/kg。按照等比遞增,在68mg
2、/kg—500mg/kg范圍內(nèi),設(shè)立11個劑量。取成年健康小鼠144只,每組12只,隨機分為12組,留備一組,不同劑量組以設(shè)定的濃度分別按0.2ml/10g灌胃,觀察72h內(nèi)小鼠口服不同劑量復(fù)合蛇毒的死亡率,以Bliss法求得小鼠口服復(fù)合蛇毒的半數(shù)致死量(LD50)。⑵健康成年小鼠,雌雄兼用,以1/4 LD50為給藥劑量,灌胃給藥,連續(xù)5d,2次/d,最后一次給藥1.5-2h后,取眼球采血,以常規(guī)方法制備血清,即為口服復(fù)合蛇毒小鼠血清(
3、S-CSV),于-20℃妥善保存?zhèn)溆?。⑶小鼠接種肝癌實體瘤H22,在無菌條件下,從H22腹水型荷瘤鼠抽取腹水以獲得瘤細胞懸液,通過離心、稀釋等常規(guī)處理,制備細胞懸液。取口服復(fù)合蛇毒小鼠血清,與小鼠H22腫瘤細胞懸液按體積比1:1和1:2配制小鼠含藥血清與H22細胞混懸液并使其密度為1×106/ml,以相同比例生理鹽水灌胃的未口服復(fù)合蛇毒的小鼠血清為對照。小鼠按性別隨機分4組,于右腋下分別接種上述腫瘤細胞混懸液0.2ml,小鼠常規(guī)飼養(yǎng)10
4、天,觀察不同組小鼠腫瘤生長情況,于第11天處死小鼠,記錄小鼠稱重及腫瘤組織重量。⑷人結(jié)腸癌細胞SW480,常規(guī)培養(yǎng)傳代,消化,離心,稀釋,計數(shù),制備細胞懸液備用。無菌條件下,S-CSV與人結(jié)腸癌細胞SW480以1:1體積比配制細胞懸液,細胞計數(shù)為1.8×108/ml。以相同比例的未口服復(fù)合蛇毒的小鼠血清及PBS為對照。各組裸小鼠分別于右腋下接種上述癌細胞懸液0.2 ml,制成動物實體瘤模型。常規(guī)喂養(yǎng)30天。觀察不同組裸鼠成瘤情況,于第3
5、1天處死裸鼠,記下各瘤組織的重量,拍照,計算成瘤率。⑸K562細胞,常規(guī)培養(yǎng)傳代,消化,離心稀釋,制備單細胞懸液,使其密度為5×104/mL,分S-CSV試驗組、空白血清組和陰性對照組。試驗組每孔分別加入含32%、16%、8%、4%、2%、1%、0.5%和0.25%S-CSV培養(yǎng)液。每個濃度復(fù)種4孔。對照組兩組,空白血清組加等量服用生理鹽水小鼠血清,陰性對照組加等量培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)6、12、24、36和48小時,用臺盼藍試劑染色。計數(shù)各
6、組拒染活細胞數(shù),每組細胞最終取均數(shù)值。⑹K562細胞,常規(guī)培養(yǎng)傳代,消化,離心,稀釋,制備單細胞懸液,使其密度為2×105個細胞/ml,分S-CSV試驗組和對照組,對照組復(fù)種6孔,試驗組不同濃度復(fù)種3孔,每孔0.1ml。試驗組每孔分別加入含10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%的S-CSV的培養(yǎng)液(口服復(fù)合蛇毒小鼠血清與培養(yǎng)液進行配比),對照組按等量的培養(yǎng)液培養(yǎng),兩組經(jīng)2h、4h、8h、16h、32h時間后,計算抑制率(臺盼藍
7、排染法)和半數(shù)抑制濃度(IC50)(直線回歸法)。抑制率=(1-藥物組活細胞數(shù)/對照組活細胞數(shù))×100%。⑺制備人結(jié)腸癌細胞SW480細胞懸液,計數(shù)2×105/ml,接種于6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24小時后,試驗組換成含20%S-CSV的培養(yǎng)液,對照組為含20%未口服復(fù)合蛇毒小鼠血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)6小時后,用PBS沖洗三次,吸去PBS,加入適量胰酶消化約2分鐘,應(yīng)用流式細胞儀檢測各組細胞其凋亡的情況。
結(jié)果:①小鼠口服復(fù)合蛇毒的L
8、D50為141mg/kg。②H22細胞在接種到小鼠之前,分別以33%和50%S-CSV與之共育20-30min,接種10d后小鼠的瘤重分別為1.03±0.53 g和0.70±0.37 g,相比于相應(yīng)的對照組的瘤重2.81±1.62 g和2.47±1.42 g重量明顯減輕,具有顯著性差異(p<0.001),其抑瘤率分別為63.16%和71.53%。③S-CSV預(yù)處理SW480后接種于裸小鼠,移植瘤的成瘤率為60%(3/5),腫瘤均重為0.
9、024±0.023g,與對照血清組(S-C)的80%(4/5)成瘤率,和0.217±0.160g的瘤重相比具有顯著性差異(p<0.001),空白對照組(PBS)100%(5/5)的成瘤率,0.737±0.220g平均瘤重相比差別極其顯著(p<0.0001),說明口服復(fù)合蛇毒小鼠血清明顯抑制裸鼠SW480移植瘤的形成和生長。④運用臺盼藍排染法計數(shù),觀察得S-CSV對體外培養(yǎng)的K562人慢性粒細胞白血病細胞株的細胞生長有明顯抑制作用。0.6
10、25%的口服復(fù)合蛇毒小鼠血清作用16h后即可抑制 K562細胞生長。隨著濃度的增加,抑制作用越強,起效越快,呈時間和劑量依賴性。⑤流式細胞定量檢測法觀察S-CSV對體外培養(yǎng)SW480的作用,發(fā)現(xiàn)S-CSV具有促腫瘤細胞凋亡作用。經(jīng) S-CSV處理的細胞凋亡率19.3%,與對照血清的0.1%相比具有顯著差異,說明口服復(fù)合蛇毒小鼠血清的抗腫瘤活性與其促腫瘤細胞凋亡有關(guān)。
結(jié)論:口服復(fù)合蛇毒小鼠血清對小鼠H22移植性實體瘤及裸鼠SW
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