從桃紅芪術(shù)軟肝煎抗肝纖維化探討孫桂芝教授防治肝癌經(jīng)驗(yàn)內(nèi)涵.pdf

1、孫桂芝教授是著名的中西醫(yī)結(jié)合腫瘤專家，從事臨床腫瘤防治工作近60年，診治中晚期腫瘤患者幾十萬(wàn)人，尤以治療消化道腫瘤而著稱，運(yùn)用“治未病”思想治療肝纖維化/肝硬化、防治肝癌積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。肝癌死亡率位居我國(guó)腫瘤死亡率第3位，并且肝癌發(fā)展迅速，患者生存期較短。我國(guó)是乙肝大國(guó)，“肝炎-肝纖維化/肝硬化-肝癌”是肝癌發(fā)展的3部曲，研究發(fā)現(xiàn)80％肝癌患者發(fā)病于肝纖維化，結(jié)合祖國(guó)醫(yī)學(xué)“治未病”思想，孫桂芝教授認(rèn)為對(duì)于肝癌的防治應(yīng)當(dāng)以防為主，防

2、治結(jié)合，具體表現(xiàn)為:“未病先防”即防治肝纖維化/肝硬化;“既病防變”即積極治療肝纖維化/肝硬化，防止向肝癌進(jìn)展;“治病于初”，即積極治療肝纖維化/早期肝硬化。
　　本課題通過總結(jié)孫桂芝教授臨床治療肝纖維化/肝硬化經(jīng)驗(yàn)，選取具有肝纖維化/肝硬化病史的原發(fā)性肝癌35例進(jìn)行前瞻性臨床研究，采用“無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)”和主題模型技術(shù)進(jìn)行挖掘分析，對(duì)孫桂芝老師治療肝纖維化防治肝癌臨床辨證施治特點(diǎn)及遣方用藥規(guī)律進(jìn)行深度解析，在此基礎(chǔ)上，采用體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)

3、相結(jié)合方法，對(duì)孫桂芝治療肝纖維化防治肝癌經(jīng)驗(yàn)方“桃紅芪術(shù)軟肝煎”從阻斷肝纖維化生成、TGF-β/Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究，從一個(gè)側(cè)面闡釋孫桂芝老師學(xué)術(shù)思想的科學(xué)內(nèi)涵。
　　論文主要內(nèi)容分為三部分:
　　第一部分:對(duì)孫桂芝教授辨治肝纖維化/肝硬化，防治肝癌的學(xué)術(shù)思想及診療特點(diǎn)進(jìn)行理論挖掘。
　　從肝纖維化古今文獻(xiàn)挖掘和臨床跟師學(xué)習(xí)，深入領(lǐng)會(huì)孫桂芝老師治療肝纖維化/肝硬化，防治肝癌的學(xué)術(shù)思想。
　　1

4、.基于孫桂芝老師的“未病先防”思想從“益氣活血，軟堅(jiān)散結(jié)”“補(bǔ)益脾胃”治療肝纖維化。
　　2.孫桂芝老師認(rèn)為肝癌的治療應(yīng)當(dāng)以“益氣活血軟堅(jiān)解毒”為治療大法，常用黃芪建中湯、藤虎湯、活血利水方等治療。
　　第二部分臨床研究:對(duì)孫桂芝教授臨床抗肝纖維化防治肝癌診療特點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和療效分析。
　　分析35例既往有肝硬化/肝纖維化病史的原發(fā)性肝癌患者的臨床信息，進(jìn)行前瞻性分析，采用“無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)”和主題模型技術(shù)挖掘，對(duì)孫桂芝老

5、師臨床辯治特點(diǎn)、遣方用藥規(guī)律等進(jìn)行進(jìn)深入研究。
　　1.臨床療效:患者客觀療效治療后穩(wěn)定率高于治療前;乏力、神疲懶言、皮膚瘙癢、口干口苦、腹脹痛、急躁易怒、太息、脅痛、水腫等癥狀均有好轉(zhuǎn);谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、甲胎蛋白均下降;白蛋白較治療前上升;紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板均較治療前升高;生命質(zhì)量評(píng)分有明顯提高。
　　2.數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果:在孫桂芝師診治的35例肝癌伴肝纖維化/肝硬化的患者中，總結(jié)出位居前4位的證候-“核心

6、證候”，同時(shí)，根據(jù)藥物節(jié)點(diǎn)、緊密度及使用頻次，總結(jié)出對(duì)應(yīng)4個(gè)核心證候的4個(gè)“核心方劑”，其中，“氣滯血瘀核心方劑”對(duì)應(yīng)藥物為:醋山甲、醋鱉甲、白芍、玫瑰花、綠鄂梅、陳皮、水紅花子、地龍等。“毒邪侵襲核心方劑”對(duì)應(yīng)藥物為:虎杖、藤梨根、白花蛇舌草、重樓、土茯苓?！把龀煞e核心方劑”對(duì)應(yīng)藥物為:醋鱉甲、醋山甲、虎杖、水紅花子、地龍、桃仁、雞內(nèi)金、莪術(shù)等?！捌⒛I不足核心方劑”對(duì)應(yīng)藥物為:黃芪、白芍、太子參、制何首烏、枸杞子、女貞子等。根據(jù)主題

7、模型的研究，得出證候與中藥對(duì)應(yīng)的概率值較高的5組主題，分別是:心脾兩虛證:多用太子參、當(dāng)歸、土茯苓、遠(yuǎn)志、麩炒白術(shù)等藥物;毒邪侵襲證:常加用虎杖、重樓、醋龜甲等藥物;氣滯血郁證多用桃仁、地龍、醋鱉甲、蜈蚣等藥物;血瘀成積證多用炮山甲、醋鱉甲等藥物;脾腎不足證多用黃芪、制何首烏、白芍等藥物;脾虛水停證常用生白術(shù)、豬苓、黃芪等藥物。根據(jù)臨床研究及數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，將數(shù)據(jù)結(jié)果與孫桂芝老師通過提交紙質(zhì)文檔、訪談探討、審閱修改等方式，總結(jié)出孫桂芝老師

8、治療肝癌伴肝纖維化/肝硬化的經(jīng)驗(yàn)方藥，主要藥物包括:生黃芪、炒白術(shù)、太子參、桃仁、莪術(shù)等藥物。全方有健脾益氣、活血化瘀、軟堅(jiān)消癥之意，體現(xiàn)孫桂芝老師扶正培本、益氣活血、軟堅(jiān)散結(jié)的臨證診治思路。
　　第三部分體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證:揭示孫桂芝教授辨治肝纖維化臨床療效的分子機(jī)制，闡釋孫桂芝經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)內(nèi)涵。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)擬采用50％CCL4橄欖油溶液腹腔注射Wistar大鼠制備肝纖維化大鼠模型，制備肝纖維化模型，造模同時(shí)使用“桃紅

9、芪術(shù)軟肝煎”低、中、高劑量干預(yù)治療，并與和秋水仙堿、扶正化瘀膠囊進(jìn)行對(duì)照觀察。于造模給藥3、6、9周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行阻斷肝纖維化進(jìn)展的動(dòng)態(tài)觀察，和與TGF-β/Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化直接相關(guān)指標(biāo)的免疫組化蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)。
　　體外實(shí)驗(yàn)選擇Hep-G2作為低分化的肝臟干細(xì)胞，體外加入重組TGF-β蛋白干預(yù)，造體外肝纖維化模型，用“桃紅芪術(shù)軟肝煎”含藥血清體外干預(yù)，免疫熒光法和Western Blot方法檢測(cè)桃紅芪術(shù)軟

10、肝煎對(duì)Hep-G2細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，探討“桃紅芪術(shù)軟肝煎”治療肝纖維化的療效與機(jī)制，為闡釋孫桂芝老師臨床經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)療效分析:
　　1.1藥物干預(yù)治療后，不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)大鼠肝纖維化程度比較
　　第3、6、9周的大鼠肝臟HE染色及Masson染色提示:第3周大鼠肝臟組織發(fā)生部分纖維化，桃紅芪術(shù)中劑量組及高劑量組改善最為明顯;第6周模型組大鼠肝臟組織形成假小葉，提示

11、造模成功，桃紅芪術(shù)軟肝煎及扶正化瘀膠囊、秋水仙堿對(duì)于大鼠肝纖維化均具有明顯的緩解作用，桃紅芪術(shù)高劑量組改善較其他組顯著;第9周各組大鼠肝臟組織均形成假小葉，桃紅芪術(shù)中劑量組及高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)改善最為明顯。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著造模給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各給藥組均有阻斷模型大鼠肝組織纖維化進(jìn)展的功效。與模型對(duì)照組比，第9周時(shí)桃紅芪術(shù)高劑量組作用最為明顯。
　　1.2不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)大鼠肝組織免疫組化蛋白表達(dá)結(jié)果。
　　第3、6

12、、9周的大鼠肝臟免疫組化染色病理圖片提示:與空白組相比較，模型組E-cadherin較空白組表達(dá)減弱，而TGF-β1、Vimentin、Smad2的表達(dá)較空白組表達(dá)增強(qiáng)，提示大鼠肝臟組織持續(xù)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，說明大鼠肝臟纖維化可能是通過發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)發(fā)形成的;與模型對(duì)照組比，桃紅芪術(shù)軟肝煎可上調(diào)E-cadherin，下調(diào)TGF-β1及Vimentin、Smad2蛋白表達(dá)，提示桃紅芪術(shù)軟肝煎可能通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路，降低S

13、mad2蛋白表達(dá)，從而下調(diào)TGF-β1，上調(diào)E-cadherin，下調(diào)Vimentin表達(dá)，發(fā)揮改善上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，治療肝纖維化的作用，其中以桃紅芪術(shù)軟肝煎中劑量組及高劑量組效果最為顯著。
　　1.3熒光定量PCR檢測(cè)肝組織E-cadherin、TGF-β1、Vimentin、Smad2 mRNA表達(dá):
　　第3、6、9周大鼠肝臟組織mRNA表達(dá)說明:與空白組相比，模型組E-cadherinmRNA表達(dá)量下降，TGF-β1mR

14、NA、Smad2 mRNA、Vimentin mRNA表達(dá)量上升，提示肝纖維化形成過程中，大鼠肝臟組織持續(xù)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可能是通過TGF-β/Smad信號(hào)調(diào)節(jié)發(fā)生的;與模型對(duì)照組比，桃紅芪術(shù)軟肝煎可上調(diào)E-cadherinmRNA，下調(diào)TGF-β1mRNA及Vimentin mRNA表達(dá)、Smad2 mRNA表達(dá)，桃紅芪術(shù)軟肝煎各劑量組均有較好的療效提示桃紅芪術(shù)軟肝煎可能通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路，影響調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（E

15、pithelial-mesenchymal transition，EMT），發(fā)揮治療肝纖維化作用。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)研究
　　體外研究Hep-G2細(xì)胞，使用Recombinant Human TGF-β1誘導(dǎo)制作肝纖維化體外模型，從免疫熒光和Western Blot研究探討桃紅芪術(shù)軟肝煎抗肝纖維化的分子機(jī)制。
　　2.1免疫熒光結(jié)果顯示:
　　與空白組比較，模型組細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減弱，Smad2、TG

16、F-β R1、Vimentin表達(dá)增強(qiáng);與模型組比，用藥組可以上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)Smad2、TGF-β R1、Vimentin表達(dá)，說明桃紅芪術(shù)軟肝煎低劑量組、桃紅芪術(shù)軟肝煎中劑量組、桃紅芪術(shù)高劑量組及扶正化瘀膠囊組、秋水仙堿組均具有較好療效。
　　2.2 Western Blot蛋白定量分析顯示:
　　與空白組比較，模型組E-cadherin表達(dá)下降，Vimentin、TGF-β R1表達(dá)上升，說明體外肝纖

17、維化細(xì)胞模型造模成功，并且Smad2表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)TGF-β R1表達(dá)增強(qiáng)，從而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;與模型組相比，桃紅芪術(shù)低、中、高劑量組可以上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)Vimentin、TGF-β R1、Smad2表達(dá)，其中以桃紅芪術(shù)軟肝煎中劑量和高劑量組療效最好，扶正化瘀膠囊和秋水仙堿也有相似療效。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)從阻斷肝纖維化組織病理變化，肝組織免疫組化蛋白表達(dá)、mRNA表達(dá)，以及體外實(shí)驗(yàn)Hep-G2細(xì)胞免疫熒光和West

18、ern Blot研究，均取得了比較一致的結(jié)果:經(jīng)驗(yàn)方桃紅芪術(shù)軟肝煎抗肝纖維化療效作用明顯、肯定。研究結(jié)果從一個(gè)側(cè)面闡釋了孫桂芝老師治療肝纖維化防治肝癌經(jīng)驗(yàn)的理論內(nèi)涵。
　　本課題特色與創(chuàng)新之處:
　　1.引入現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)，采用“無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)”和“主題模型”技術(shù)分析對(duì)35例既往有肝纖維化/肝硬化病史的原發(fā)性肝癌，總結(jié)出“核心證候”對(duì)應(yīng)的治則治法及“核心方藥”，通過對(duì)孫桂芝老師臨床學(xué)習(xí)、提交紙質(zhì)文檔、訪談探討及審閱批改，對(duì)孫

19、桂芝老師治療肝纖維化的辨證特點(diǎn)、病因病機(jī)、治療策略、遣方用藥特點(diǎn)進(jìn)行深層次解析，提出了孫桂芝老師治療肝纖維化運(yùn)用“益氣活血，軟堅(jiān)散結(jié)”“補(bǔ)益脾胃”辨治原則和核心方藥，為傳承挖掘名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)提供新思路。
　　2.本研究采用大鼠肝纖維化模型和人Hep-G2細(xì)胞模型，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，從肝纖維化病理組織形態(tài)、E-cadherin、Vimentin、Smad2、TGF-β1、TGF-β R1免疫組化蛋白及RT-PCR測(cè)定mRNA基因表達(dá)、