復(fù)方鱉甲軟肝片及其聯(lián)合嬰兒雙歧桿菌抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討復(fù)方鱉甲軟肝片及其和嬰兒雙歧桿菌聯(lián)用治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的作用及其機(jī)制。
　　方法：采用三種不同的肝纖維化動(dòng)物模型研究復(fù)方鱉甲軟肝片及嬰兒雙歧桿菌治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的作用，全文共分四個(gè)部分：①?gòu)?fù)方鱉甲軟肝片對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的大鼠化學(xué)損傷性肝纖維化的防治作用。采用CCl4制備大鼠肝纖維化模型。將雄性SD大鼠隨機(jī)分為：正常組，模型組，復(fù)方鱉甲軟肝片0.6 g/kg、1.2g/kg和2.4g/kg組，秋水仙堿0.5mg

2、/kg組。除正常組外，各組大鼠給予純CCl4溶液皮下注射，之后每4天皮下注射40％CCl4橄欖油溶液建立肝纖維化動(dòng)物模型；正常組腹腔注射等量生理鹽水。治療組在給予 CCl4同時(shí)灌胃給予復(fù)方鱉甲軟肝片0.6 g/kg、1.2g/kg和2.4g/kg組，秋水仙堿0.5mg/kg；正常組和模型組等量飲用水灌胃。連續(xù)給藥8周后，測(cè)定大鼠肝臟重量（liver weight，LW）、肝臟質(zhì)量指數(shù)(liver weight index，LWI)、肝功

3、能，血清透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）和III型前膠原肽（precollagen pepride III，PCIII），肝臟羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量，病理切片HE染色和苦味酸天狼猩紅染色觀察肝臟組織病變情況和膠原纖維含量，測(cè)定肝臟組織血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）、抗氧化物和氧化應(yīng)激產(chǎn)物、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和基質(zhì)金屬

4、蛋白酶抑制因子（tissue inhibitors of metaslloproteinases，TIMP），蛋白免疫印跡法觀察藥物對(duì)肝臟TGF-β1/smad信號(hào)通路的影響。②復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)大鼠酒精性肝纖維化的防治作用。建立酒精誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型。雄性SD大鼠隨機(jī)分為：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，復(fù)方鱉甲軟肝片0.6g/kg組，復(fù)方鱉甲軟肝片1.2g/kg組，復(fù)方鱉甲軟肝片2.4g/kg組，秋水仙堿0.5mg/kg組。除正常對(duì)照組給予

5、蒸餾水灌胃外，各組大鼠每天上午給予白酒灌胃，每天下午各組大鼠給予相應(yīng)的藥物溶液或蒸餾水，給藥體積15ml/kg，連續(xù)10周后，測(cè)定大鼠肝臟重量，肝臟質(zhì)量指數(shù)、肝功能，血清透明質(zhì)酸和III型前膠原肽，病理切片HE染色觀察肝臟組織病理結(jié)構(gòu)，測(cè)定肝臟組織抗氧化物、氧化應(yīng)激產(chǎn)物和I/III型膠（Collagen I/III）原蛋白濃度，RT-PCR法檢測(cè)肝臟CYP2E1mRNA相對(duì)表達(dá)量，蛋白免疫印跡法檢測(cè)肝臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transfo

6、rming growth factor，TGF-β1）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)量。③復(fù)方鱉甲軟肝片和嬰兒雙歧桿菌連用聯(lián)用對(duì)刀豆蛋白誘導(dǎo)的小鼠免疫損傷性肝纖維化的防治作用。用刀豆蛋白誘導(dǎo)免疫性小鼠肝纖維化模型,將雄性 Balb/c小鼠隨機(jī)分為8組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，復(fù)方鱉甲軟肝片0.9 g/kg組，復(fù)方鱉甲軟肝片1.8g/kg組，復(fù)方鱉甲軟肝片3.6g/kg組，復(fù)方鱉甲軟肝片

7、1.8g/kg和嬰兒雙歧桿菌0.5g/kg聯(lián)用組，嬰兒雙歧桿菌0.5g/kg組，秋水仙堿0.75mg/kg組。正常對(duì)照組靜脈注射給予注射用生理鹽水，其余各組小鼠按12.5mg/kg劑量靜脈注射給予刀豆蛋白溶液，每周一次，造模同時(shí)給藥，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予蒸餾水灌胃，其余各組給予相應(yīng)的藥物溶液，每日1次，持續(xù)7周后，檢測(cè)小鼠肝臟重量，肝臟質(zhì)量指數(shù)、肝功能，血清透明質(zhì)酸和III型前膠原肽蛋白濃度，肝臟組織TNF-α、IL-6、IL-1

8、0、MMP-1、MMP-2、MMR-9、Collagen I/III的蛋白濃度，TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)量。④肝纖維化大鼠的肝臟彩色多普勒超聲圖像及實(shí)時(shí)組織彈性成像的研究。用肝臟彩色超聲多普勒?qǐng)D像及實(shí)時(shí)組織彈性成像技術(shù)觀察復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì) CCl4和酒精誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟生理結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：①?gòu)?fù)方鱉甲軟肝片能顯著降低 CCl4致肝纖維化大鼠肝臟重量，肝臟質(zhì)量指數(shù)，改善肝功能，緩解肝臟病變；減少血清 HA、PCI

9、II，肝臟 Hyp，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、p-samd2/3和CollagenI/III表達(dá)，提高肝臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px），超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，上調(diào)MMP-1和smad7表達(dá)。②復(fù)方鱉甲軟肝片能顯著降低酒精致肝纖維化大鼠的肝臟重量，肝臟質(zhì)量指數(shù)，改善

10、肝功能，緩解肝臟病變；減少血清 HA、PCIII，肝臟 Hyp、MDA、Collagen I/III、TGF-β1和α-SMA含量，下調(diào)肝臟CYP2E1mRNA表達(dá)，提高肝臟谷GSH-Px，SOD活力。③復(fù)方鱉甲軟肝片能顯著降低刀豆蛋白致免疫性肝纖維化小鼠的肝臟重量，肝臟質(zhì)量指數(shù)，改善肝功能，降低肝臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β1和Collagen I/III表達(dá)，升高肝臟MMP-1含量，但其對(duì)免疫誘導(dǎo)所引起的炎癥因

11、子表達(dá)無(wú)明顯作用。嬰兒雙歧桿菌能有效的降低免疫性肝纖維化小鼠肝臟組織TNF-α，IL-6濃度，升高IL-10濃度。復(fù)方鱉甲軟肝片與嬰兒雙歧桿菌聯(lián)用對(duì)于免疫所致肝纖維化治療效果優(yōu)于單用。④治療組的大鼠的肝臟彈性藍(lán)色區(qū)域明顯小于模型組。
　　結(jié)論：⑴復(fù)方鱉甲軟肝片具有良好的抗肝纖維化作用，能夠顯著改善肝功能，抑制ECM成分過(guò)度合成。其作用機(jī)制與抗氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)肝臟MMPs和TIMPs表達(dá)，干預(yù)TGF-β1/smad信號(hào)通路有關(guān)，其抗纖