荔枝果皮中根皮苷的提取、純化、鑒定以及根皮素的人體美白功效評價.pdf

1、具有美白功效的化妝品是目前最受歡迎的化妝品之一，尤其在亞洲地區(qū)，采用天然美白成分的產(chǎn)品最受人們的推崇。根皮素是國內(nèi)外新近研究開發(fā)的新型美白劑和抗氧化劑，屬于黃酮類物質(zhì)中的二氫查耳酮，據(jù)文獻(xiàn)報道，在植物中根皮素多以糖苷的形式存在。根皮素和根皮苷在自然界中分布較少，主要存在于蘋果、梨等植物的根莖和根皮。 荔枝是中國嶺南地區(qū)盛產(chǎn)的特色水果，而且深受人們喜愛。既往對荔枝果皮的研究發(fā)現(xiàn)，荔枝皮提取物有很強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化成分中含有黃

2、酮類物質(zhì)。由此推測，荔枝果皮中可能含有根皮苷。如能從荔枝果皮中提取和分離根皮苷，作為一種具有美白和抗衰老活性的天然原料應(yīng)用于化妝品中，不僅來源廣泛，而且變廢為寶，可以帶來巨大的社會經(jīng)濟(jì)效益。 目前，國內(nèi)外在天然植物中提取根皮苷的方法主要是有機(jī)溶劑提取法、超聲波浸提法、微波輔助法，分離純化主要用高效液相色譜法、硅膠柱層析法和薄層層析法，鑒定的手段為紫外分光光度法、質(zhì)譜法和核磁共振法。其中，有機(jī)溶劑提取法、超聲波浸提法、高效液相色譜

3、法、質(zhì)譜法和核磁共振法效率較高，是適用于實(shí)驗(yàn)室操作的成熟技術(shù)。 美白劑功效評價的方法有以下幾種：酪氨酸酶活性測定、細(xì)胞內(nèi)黑色素含量測定、人體皮膚試驗(yàn)法。人體皮膚試驗(yàn)法是最直接有效的評價方法，以往的試驗(yàn)大多數(shù)是將美白劑涂抹在病變皮膚上，一段時間后以肉眼觀察和儀器檢測祛斑效果。由于人體皮膚色斑類型繁多、成因復(fù)雜，個體差異極大，試驗(yàn)存在許多不可控制的影響因素。因此，目前國際上常用具有良好均一性和重現(xiàn)性的人工紫外線誘導(dǎo)正常皮膚黑斑的方法

4、作為人體皮膚美白功效試驗(yàn)的模型。 文獻(xiàn)中誘導(dǎo)黑斑的的紫外線，通常選擇中波紫外線(UVB，波段290-320nm)，或者是連續(xù)波長紫外線(UVA+UVB，波段290-400 nm)。但近年來一些研究顯示，同樣劑量的長波紫外線(UVA，波段320-400 nm)比UVB誘導(dǎo)的黑斑更加持久，紅斑反應(yīng)卻比UVB輕微，提示了選擇UVA作為誘導(dǎo)黑斑模型的紫外線波段可能是更加有效和安全的方法。 對于皮膚顏色變化的判定，近年來國外普遍使

5、用國際照明委員會(CIE)規(guī)定的色度系統(tǒng)(L*a*b*色度系統(tǒng))測量皮膚顏色的變化，以及皮膚黑色素和血紅素測試儀測量皮膚黑色素的含量兩種方法。L*a*b*色度系統(tǒng)中L值表示皮膚的亮度，數(shù)值越大皮膚越亮；a值表示皮膚的紅綠色度，數(shù)值越大皮膚越偏向紅色；b值表示皮膚藍(lán)黃色度，數(shù)值越大皮膚越偏向黃色。皮膚色度角(Individual Typology Angle，ITA°)是由L值和b值計(jì)算出來的色度角，分為Ⅰ～Ⅵ級，也是表示皮膚顏色深淺的一

6、個較綜合的指標(biāo)。黑色素和血紅素測試儀測量皮膚的黑色素指數(shù)和血紅素指數(shù)，分別表示皮膚中的黑色素含量和血紅素含量。 目前關(guān)于根皮素的美白功效研究結(jié)果顯示，體外酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)中根皮素能競爭性抑制酪氨酸酶活性，并呈劑量依賴，其抑制率優(yōu)于目前許多美白產(chǎn)品中使用的熊果苷和曲酸。細(xì)胞水平的研究也發(fā)現(xiàn)，小鼠B16細(xì)胞和人上皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中加入根皮素后，其酪氨酸酶活性、黑色素含量都較對照組低。但是迄今為止國內(nèi)外尚沒有評價根皮素美白功效的人體皮

7、膚試驗(yàn)的研究報道。 本研究首次成功地從我國嶺南特色水果荔枝的果皮中提取和純化根皮苷單體，首次使用UVA誘導(dǎo)的人體正常皮膚黑斑模型以及首次驗(yàn)證了根皮素具有人體皮膚美白的功效。從而有助于根皮素進(jìn)一步的臨床應(yīng)用以及我國化妝品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 方法： 1.荔枝果皮中根皮苷的提取、純化和鑒定。運(yùn)用70％乙醇溶液浸泡法以及超聲波輔助法提取荔枝果皮中的根皮苷。(1)運(yùn)用D101大孔樹脂吸附分離法、固相萃取法和高效液相色譜法純化提取

8、液中的根皮苷單體。(2)運(yùn)用質(zhì)譜法對純化的根皮苷單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。 2.UVA誘導(dǎo)的人體皮膚黑斑模型。(1)受試者選擇：按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)納入20名健康志愿者，詳細(xì)告知試驗(yàn)?zāi)康摹?nèi)容及流程等以及試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，受試者以自愿為原則簽署知情同意書后進(jìn)入本試驗(yàn)。試驗(yàn)方案已經(jīng)過過中山大學(xué)附屬三院倫理委員會批準(zhǔn)。(2)UVA劑量與方法：照射部位為非曝光性的大腿內(nèi)側(cè)。測量受試者的MED后，用1MED劑量的UVA照射受試部位，每天一次，連

9、續(xù)照射3天。(3)皮膚顏色的測量：使用CIE規(guī)定的色度系統(tǒng)(L*a*b*色度系統(tǒng))測量皮膚顏色的變化，以及皮膚黑色素和血紅素測試儀測量皮膚黑色素含量和血紅素含量。觀察時間為8周。 3.根皮素的人體美白功效評價。(1)受試者選擇：按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)納入20名健康志愿者，詳細(xì)告知試驗(yàn)?zāi)康?、?nèi)容及流程等以及試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，受試者以自愿為原則簽署知情同意書后進(jìn)入本試驗(yàn)。試驗(yàn)方案已經(jīng)過中山大學(xué)附屬三院倫理委員會批準(zhǔn)。(2)研究方法：隨

10、機(jī)、雙盲和對照研究方法。在大腿內(nèi)側(cè)用UVA劑量和方法同時誘導(dǎo)5個黑斑，分別外用賦形劑、3％熊果苷霜、0.5％根皮素霜、1％根皮素霜和3％根皮素霜，每天2次，連續(xù)8周。(3)美白功效評價：使用CIE規(guī)定的色度系統(tǒng)(L*a*b*色度系統(tǒng))測量黑斑顏色的變化，以及皮膚黑色素和血紅素測試儀測量皮膚黑色素含量，每周隨訪一次。(4)安全性評估：5種霜劑在人體試驗(yàn)前先行斑貼試驗(yàn)。使用過程中觀察可能的不良反應(yīng)。 結(jié)果： 1.純化后的根皮

11、苷單體的質(zhì)譜曲線與根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜曲線基本吻合。 2.UVA誘導(dǎo)的皮膚黑斑L*值和b*值誘導(dǎo)后第一天分別明顯下降和上升，隨后第2天至第56天緩慢上升和下降，變化不顯著(P>0.05)。ITA°變化與L*值一致。黑色素指數(shù)在誘導(dǎo)后逐漸上升，第8天達(dá)到最大值，約為照射前黑色素指數(shù)的2倍。第2到8周黑色素指數(shù)緩慢下降，變化不顯著(P>0.05)。a*值和血紅素指數(shù)在誘導(dǎo)后第一天顯著升高并達(dá)到峰值，之后到第14天逐漸下降，第14天到5

12、6天變化不顯著(P>0.05)。 3.使用3％熊果苷霜和3％根皮素霜的黑斑，其b*值和黑色素指數(shù)明顯低于使用賦形劑的黑斑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3％熊果苷霜組和3％根皮素霜組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0.5％根皮素霜組、1％根皮素霜組和3％根皮素霜組的黑色素指數(shù)依次降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論： 1.荔枝果皮中含有根皮苷。 2.70％乙醇溶液浸泡法以及超聲波輔助法