利用pH和甲醇在線控制策略促進(jìn)Pichia Pastoris GS115發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶.pdf

1、堿性果膠酶(Alkaline polygalacturonate lyase，PGL，E.C.4.2.2.2)，是一種廣泛應(yīng)用于紡織工業(yè)棉織物煮煉中的酶。為了提高發(fā)酵法生產(chǎn)PGL的產(chǎn)量，在前期的研究中從一株P(guān)GL高產(chǎn)菌株中擴(kuò)增出編碼該酶的基因，并成功表達(dá)于畢赤酵母(P.pastoris)GS115中。本論文在此基礎(chǔ)上，通過(guò)詳盡分析誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基不同pH和甲醇濃度對(duì)P.pastoris GS115高效表達(dá)堿性果膠酶的影響，提出了pH控制策

2、略和甲醇濃度控制策略，并將兩者進(jìn)行結(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)了PGL的高效生產(chǎn)。在考察培養(yǎng)基pH對(duì)PGL生產(chǎn)的影響時(shí)，首先將菌體生長(zhǎng)階段的pH控制在5.5，誘導(dǎo)階段采用不同的pH；在甲醇在線控制策略中，培養(yǎng)基的pH值控制在5.5，誘導(dǎo)階段通過(guò)在線流加不同濃度的甲醇研究甲醇濃度對(duì)PGL生產(chǎn)的影響。為了進(jìn)一步提高PGL的產(chǎn)量，在綜合考慮甲醇消耗、最優(yōu)pH、細(xì)胞活力和PGL產(chǎn)量的基礎(chǔ)上，把誘導(dǎo)階段分為兩個(gè)時(shí)期(菌體生長(zhǎng)階段結(jié)束至誘導(dǎo)后40 h的誘導(dǎo)階段稱

3、為過(guò)渡時(shí)期)，并將pH控制策略結(jié)合甲醇在線控制策略應(yīng)用于誘導(dǎo)階段，與恒速流加甲醇相比，該策略使PGL的產(chǎn)量提高了100%，達(dá)到1631 U/mL。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、AOX酶活和胞內(nèi)能荷水平等參數(shù)，證明了該策略在高效生產(chǎn)PGL的過(guò)程中能有效地促進(jìn)菌體生產(chǎn)PGL的能力。
　　 前期的研究成果為:從分離篩選得到的一株堿性果膠酶高產(chǎn)菌株Bacillus sp。WSHB04-02中，擴(kuò)增出編碼堿性果膠酶的基因，并成功表達(dá)于P.pas

4、toris GS115中；通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分、采用高密度發(fā)酵以及考察甲醇濃度和細(xì)胞濃度的比率等因素，使PGL的產(chǎn)量達(dá)到800 U/mL。本論文在此基礎(chǔ)上對(duì)PGL生產(chǎn)的關(guān)鍵因素pH和甲醇濃度進(jìn)行了以下研究:
　　 1)為提高重組p.pastoris GS115發(fā)酵牛產(chǎn)堿性果膠酶的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，在3 L發(fā)酵罐中考察了6個(gè)不同的pH(6.s、5.5、4.5、3.5、5、4)對(duì)重組畢赤酵母生產(chǎn)PGL的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH為4.5時(shí)，

5、PGL產(chǎn)量達(dá)到1362 U/mL，細(xì)胞干重為144g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，細(xì)胞活力仍然可以維持在80%，在整個(gè)誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)基中甲醇濃度維持在17 mL/L:而其他pH水平對(duì)PGL的生產(chǎn)則沒(méi)有很明顯的促進(jìn)作用。
　　 2)在pH控制策略的基礎(chǔ)上，為了研究甲醇濃度對(duì)PGL發(fā)酵生產(chǎn)的影響，在3L發(fā)酵罐上依次考察了5個(gè)不同的甲醇水平(8 mL/L，，12mL/L，16 mL/L，20 mL/L和24mL/L)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的作用。結(jié)果表明，培

6、養(yǎng)基中維持16 mL/L的甲醇濃度最有利于PGL的生產(chǎn)，PGL的產(chǎn)量可以達(dá)到1260 U/mL，細(xì)胞干重為140 g/L，但是PGL產(chǎn)量仍然稍低于以10 mL/L的速度恒速流加甲醇時(shí)的產(chǎn)量。胞內(nèi)ATP、ADP和AMP的水平分別為1.2 g/L，0.04 g/L，0.28 g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí)細(xì)胞活力為77%。
　　 3)在以上研究的基礎(chǔ)上，本論文第一次提出了“過(guò)渡時(shí)期”的概念，在本研究中，根據(jù)菌體的生理特性，將菌體生長(zhǎng)階段結(jié)束之后

7、至誘導(dǎo)后40 h之間的一段時(shí)間稱之為過(guò)渡時(shí)期。在過(guò)渡時(shí)期采用pH5.5和較低的甲醇濃度(12 mL/L)誘導(dǎo)菌體生產(chǎn)PGL，之后的誘導(dǎo)階段pH設(shè)為4，5，分別采用16 mL/L，20 mL/L和24mL/L三個(gè)不同的甲醇濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在整個(gè)誘導(dǎo)階段，采用兩階段pH控制和甲醇濃度控制策略即pH5.5，12 mL/L(過(guò)渡時(shí)期)和pH4.5，16 mL/L(過(guò)渡時(shí)期之后的誘導(dǎo)階段)可以進(jìn)一步促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和PGL生產(chǎn)，菌體濃度可達(dá)到162g/