運(yùn)用QD-FLISA法定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中的Cry1Ab蛋白.pdf

1、目前，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、試紙條技術(shù)(latefal flow strip)和蛋白免疫印記法( Western blot)等能夠從蛋白質(zhì)水平快速、高效地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品。本論文研究了一種納米熒光材料-量子點(diǎn)(QDs)標(biāo)記抗體(IgG)的最佳連接條件，及通過(guò)熒光分光光度計(jì)對(duì)連接效果進(jìn)行鑒定。并利用轉(zhuǎn)基因玉米中殺蟲(chóng)劑蛋白(純Cry1Ab蛋白)免疫大白兔，成功研制出抗Cry1Ab蛋白多克隆抗體。運(yùn)用ELISA原理建立了QD-FLISA

2、檢測(cè)方法，并在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品方面得到初步應(yīng)用。具體內(nèi)容如下： 本實(shí)驗(yàn)首先從蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)HD-1菌株中提取得到Cry1Ab蛋白，運(yùn)用Bradford法測(cè)得蛋白濃度為2mg/mL。利用Cry1Ab蛋白質(zhì)與等量的佐劑充分乳化后采用背部皮下免疫大白兔(3kg/只)，采用間接ELISA法進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定。 然后通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終成功地將量子點(diǎn)標(biāo)記上抗體，確定其最佳溶液配比是：25μ

3、L量子點(diǎn)母液(Img/mL)，20μL EDC溶液(10mg/mL)，10μL NHS溶液(1.5mg/mL，pH7.0)和0.2mg Abs(羊抗兔抗體)在室溫下反應(yīng)4h，并采用離心過(guò)濾技術(shù)，對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的混合物分離純化。 最后建立了QD-FLISA法并優(yōu)化反應(yīng)體系，確定鼠抗Cry1Ab單克隆抗體(McAb)最佳工作濃度為10μg/mL、兔抗Cry1Ab多克隆抗體(PcAb)和QDs標(biāo)記羊抗兔IgG分別按1:1000和1:

4、500稀釋時(shí)效果最好。QD-FLISA法檢測(cè)結(jié)果是：該方法能特異地檢測(cè)Cry1Ab蛋白，與其它蛋白類似物Cry2Ab、Cry1F和Cry3Bb無(wú)交叉反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因玉米MON810的線性定量范圍是0.05-5％，測(cè)得LOD(limit of detection)和LOQ(limit ofquantification)值分別是2.956pg/mL和9.854pg/mL。相比常規(guī)夾心ELISA定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米，它的靈敏度更高，并且具有高準(zhǔn)確度