DNA模板點(diǎn)擊化學(xué)在生物傳感器中的研究與應(yīng)用.pdf

1、Cu+催化的炔化物和疊氮化物的偶極環(huán)加成反應(yīng)是“點(diǎn)擊化學(xué)”的典型例子,該反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)大量用于生物大分子的標(biāo)記。此外,這種點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)對Cu+離子催化有很高的特異性,已經(jīng)用于開發(fā)銅離子的生物傳感方法。但傳統(tǒng)的有機(jī)點(diǎn)擊反應(yīng),需要較高的反應(yīng)物濃度以及長時間的反應(yīng),并且檢測限相對偏高。
　　DNA模板有機(jī)合成(DTS)是一種極具創(chuàng)新性的技術(shù)。它能顯著地增加反應(yīng)分子的有效摩爾濃度。同時,通過DNA雜交,

2、拉近了修飾在DNA上的小分子反應(yīng)基團(tuán)之間的距離,該方法能明顯的加快反應(yīng)速率。通過DNA將DNA相關(guān)技術(shù)引入到非天然合成反應(yīng)中,有助于反應(yīng)基團(tuán)的識別、合成步驟的設(shè)計、反應(yīng)選擇性的提高以及反應(yīng)的放大?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn),DTS在許多方面都有著廣泛的應(yīng)用前景,它是小分子庫構(gòu)建、生物活性分子篩選和多肽均相合成等的有效方法。然而,DTS在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于起始階段。雖然前人在這方面研究甚少,但DTS的內(nèi)在優(yōu)勢和強(qiáng)大功能奠定了其在生物傳感中應(yīng)用的基

3、礎(chǔ)。
　　基于以上考慮,并綜合相關(guān)文獻(xiàn)報道,本論文將點(diǎn)擊反應(yīng)與DTS反應(yīng)相結(jié)合,利用DNA模板點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),開發(fā)了一系列新型的化學(xué)生物傳感方法。此外,考慮到點(diǎn)擊化學(xué)在生物大分子標(biāo)記上的卓越貢獻(xiàn),本論文將點(diǎn)擊化學(xué)引入到生物大分子自由基的檢測上來,希望能開發(fā)一些更為簡便的檢測生物大分子自由基的方法。
　　(1)構(gòu)建了一種基于DNA模板點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的新型Cu2+的熒光檢測平臺。本方法利用DNA模板點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的高特異性用于目標(biāo)分子

4、識別,DNA鏈取代和磁珠分離作為信號的傳導(dǎo),高靈敏性的SYBRGreenI染料作為信號輸出。與傳統(tǒng)的點(diǎn)擊反應(yīng)方法相比較,該方法具有更高的靈敏度和更低的檢測限(290nM)等優(yōu)點(diǎn)。此外,只需要把DNA上的疊氮基-炔基換成其他能形成共價鍵的功能基團(tuán)就可以把該傳感系統(tǒng)用于其他物質(zhì)的檢測。這為各種生物傳感器的構(gòu)建提供了一個很有潛在應(yīng)用價值的通用平臺。
　　(2)由于在前一個工作中,需要磁珠分離過程,操作比較繁瑣,而且檢測時不是在均相里完成

5、。因此,我們開發(fā)了一個更加簡便的Cu2+傳感方法,可以實(shí)現(xiàn)加入混合就能輸出信號。這種方法是基于DNA模板點(diǎn)擊反應(yīng)生成的G四面體(G4)結(jié)構(gòu)并用于高靈敏檢測Cu2+的新型熒光傳感方法。由于結(jié)晶紫與G4結(jié)合后能極大地增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度,因而被選做信號輸出分子。鑒于結(jié)晶紫能探測G4結(jié)構(gòu)的變化,我們把一段富G序列的DNA分開成兩段長度不等的短鏈DNA,然后通過DTS反應(yīng)使其連接起來并形成分子內(nèi)G4結(jié)構(gòu),而結(jié)晶紫可以用于識別這一結(jié)構(gòu)的變化。由于DTS

6、反應(yīng)的高產(chǎn)率和點(diǎn)擊化學(xué)的高特異性,這種傳感器也展示了較高的靈敏度和選擇性。此外,由于活細(xì)胞內(nèi)含有豐富的谷胱甘肽(GSH),本方法可能用于生物體內(nèi)的GSH/Cu(I)加合物檢測。因此,以本方法為例,我們證明了通過合理設(shè)計后,DTS調(diào)控的分子內(nèi)G4結(jié)構(gòu)的形成在生物傳感器的開發(fā)上具有良好的應(yīng)用前景。
　　(3)簡便、可視化檢測、可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場化檢測是未來分析檢測方法的發(fā)展趨勢,而比色分析則剛好符合這些要求。因此,我們提出了一種基于Cu+催

7、化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)和未修飾AuNPs作為比色指示劑的Cu2+比色檢測的簡便方法。用于點(diǎn)擊反應(yīng)的DNA探針由兩部分組成:一部分是一條修飾了疊氮基團(tuán)的單鏈DNA(ssDNA)與一條長鏈的ssDNA的部分堿基形成的雙鏈DNA(dsDNA);另一部分是一條與長鏈中未雜交的堿基互補(bǔ)的炔基化標(biāo)記的短鏈ssDNA。由于短鏈ssDNA與長鏈ssDNA形成的dsDNA的熔解溫度很低,在沒有Cu2+的情況下,這兩個部分在溶液中是分開的。當(dāng)溶液中存在Cu2+時

8、,銅離子催化的疊氮-炔基的點(diǎn)擊連接反應(yīng)引起了DNA結(jié)構(gòu)從分離的單鏈形式變?yōu)橥暾碾p鏈DNA結(jié)構(gòu)。由于ssDNA保護(hù)的AuNPs和dsDNA保護(hù)的AuNPs在鹽溶液中的穩(wěn)定性不同,因此可以通過調(diào)控未修飾的AuNPs的團(tuán)聚,使其從紅色變成藍(lán)色,來監(jiān)測這種DNA結(jié)構(gòu)的變化。在最佳條件下,這種傳感器具有較高的靈敏度,其線性范圍是0.5-10μM,檢測限可達(dá)到250nM。這種方法不需要對DNA進(jìn)行“雙標(biāo)記”和對金納米粒子進(jìn)行表面修飾,從而大大減少

9、了費(fèi)用和簡化了傳感器的組裝及分析過程。由于銅離子催化的炔基-疊氮基的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的高特異性,本傳感器能夠在高濃度的其他環(huán)境相關(guān)金屬離子共存下具有良好的選擇性,符合實(shí)際樣品的檢測要求。
　　(4)鑒于點(diǎn)擊化學(xué)在生物標(biāo)記上的成功經(jīng)驗(yàn),我們將點(diǎn)擊化學(xué)引入到生物大分子自由基的捕獲上來。提出了點(diǎn)擊-捕獲(Click-Trap)設(shè)計新概念,合成了多種環(huán)狀硝酮類自由基捕獲探針,并用質(zhì)譜、核磁等進(jìn)行了表征。將這些捕獲探針對氧中心和碳中心的小分子自

10、由基進(jìn)行了ESR捕獲實(shí)驗(yàn)。此外,具有點(diǎn)擊功能的炔基標(biāo)記的新型捕獲探針(Click-DMPO)也用于蛋白質(zhì)活性氧自由基的氧化性損傷的原位捕獲實(shí)驗(yàn)。較之于免疫自旋捕獲技術(shù),本方法操作更為簡單,勿需復(fù)雜的免疫實(shí)驗(yàn)操作;由于點(diǎn)擊反應(yīng)的優(yōu)異性能,有利于對Click-DMPO和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和檢測。
　　另一方面,DNA由于精確的堿基互補(bǔ)配對性質(zhì),在納米自組裝方面具有高度可控、可編碼、可圖案化、易于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子標(biāo)記等天然優(yōu)

11、勢。其自組裝形成的DNA結(jié)構(gòu)不僅可以在納米尺度上實(shí)現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的精確組裝,而且還具有良好的生物相容性,不僅是一種新型的生物納米材料,而且在分析化學(xué)中有著潛在的應(yīng)用前景。因此,研究基于DNA納米結(jié)構(gòu)的生物傳感技術(shù)亦是一項(xiàng)重要和具有挑戰(zhàn)性的工作。
　　(5)發(fā)展了一種基于DNA納米管的質(zhì)量放大效應(yīng)的熒光各向異性的高靈敏檢測ATP的傳感方法。一條長鏈的ssDNA探針包含了目標(biāo)分子的核酸適配體序列的一部分以及用于自組裝形成質(zhì)量放大熒光各向異