十字孢堿產生菌優(yōu)化及其衍生物合成研究.pdf

1、吲哚咔唑類生物堿由于其獨特的結構和良好的生物活性引起了許多有機化學家和藥物學家濃厚的興趣和熱切的關注,其中以十字孢堿(staurosporine,ST)為代表的衍生物更是由于其強的蛋白激酶C(PKC)抑制活性吸引了眾多研究者的目光。本文從十字孢堿的產生菌株出發(fā),開展了一系列的研究工作。研究內容主要有:十字孢堿產生菌的優(yōu)化——產生菌的篩選,高產菌株的選育,代謝調控研究,混合培養(yǎng)對次生代謝產物的影響以及突變高產株十字孢堿類似物的研究;另外,

2、對高產菌株規(guī)模發(fā)酵,建立了十字孢堿的提取純化方法,并對獲得的十字孢堿進行了衍生物合成工作,尋找新的活性高、毒副作用小的蛋白激酶C抑制劑。
　　 實驗室保藏的放線菌株分別來自青島膠州灣的海泥、青島東風鹽場的鹽池底泥,從中進行廣泛的篩選,獲得了3株產生十字孢堿的鏈霉菌,分別是S.fradiae007、S.arenae Z4007、S.rubrolavendulae THW-12。對這3株的十字孢堿的產量進行定量分析,發(fā)現(xiàn)產量較低,均

3、在1μg/ml左右。因此開展了高產菌株的選育工作,采用常規(guī)的理化因子誘變,通過簡便有效的紫外和亞硝基胍進行復合誘變,從菌株S.fradiae007中得到3株高產突變株:S.fradiae M297、S.fradiae M301、S.fradiae M315,其中S.fradiae M315發(fā)酵效價由原來的1.02μg·mL-1提高到9.06μg·mL-1,提高了8倍,突變株經過穩(wěn)定性試驗考察,性能穩(wěn)定。
　　 為了提高菌株的發(fā)酵

4、效價,還開展了代謝調控和混合培養(yǎng)研究。期望通過添加代謝前體、酶抑制劑以及競爭性生長因子等誘發(fā)新的次生代謝途徑。初步研究了五種常見甲基酶抑制劑對十字孢堿產生菌的影響,包括D-甲硫氨酸、D,L-乙硫氨酸、S-腺苷-L-高半胱氨酸、西奈芬凈;發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)時加入甲基化酶抑制西奈芬凈,可使THW-12產生去甲基十字孢堿,但是產量較低。通過桐花樹根部的內生真菌Penicillium citrinum WC29-5與鏈酶菌S.Fradiae007的混合

5、培養(yǎng),考察了混合培養(yǎng)對次生代謝產物的影響,獲得了10個化合物(1-10),首次確定了化合物6的絕對構型;細胞毒活性評價表明,化合物6對A549及HL-60細胞IC50值分別是0.9、0.8μM?；旌吓囵B(yǎng)的次級代謝產物與純培養(yǎng)發(fā)生了很大的變化,雖然沒有提高十字孢堿的產量,但是生成了不同于純培養(yǎng)的活性次生代謝產物,為以后進一步研究混合培養(yǎng)積累了經驗。
　　 突變株M315經過發(fā)酵條件優(yōu)化,進行大發(fā)酵(250L)。對其發(fā)酵產物進行追蹤

6、分離,建立了十字孢堿(19)的提取純化方法,同時還獲得了9個其它吲哚咔唑類生物堿,其中化合物(11-13)為新化合物,其結構特點是在十字孢堿的4'N上出現(xiàn)了取代基,化合物11出現(xiàn)了氰基,而12和13則分別在該位置出現(xiàn)了另一分子的色氨酸片段和雜原子基團。
　　 以十字孢堿為原料,以得到PKC412和UCN-01(正在進行臨床試驗研究)的鹵代產物為目標,對7-位亞甲基、4'N以及芳環(huán)進行結構修飾,研究鹵代化合物對該類化合物的影響,期

7、望得到“me-too”或者“me-better”藥物分子。目前已經合成了50個化合物,其中新化合物45個,以A549及HL-60腫瘤細胞株為模型,用SRB法或MTT法對得到的進行了化合物抗腫瘤活性評價,其中化合物116,117,123,194,207,222顯示了良好的細胞毒活性,對A549腫瘤細胞株IC50值分別為0.8、0.5、5.1、1.0、0.6、0.4μM,對HL-60腫瘤細胞株IC50值分別為1.1、1.4、4.9、1.1、

8、0.9、0.9μM;分子水平的活性評價表明,化合物123,124,126,204對PKCβ2具有很強的抑制活性,其IC50值分別為22.3,14.4,37.0,24.5nM。
　　 綜上,對十字孢堿為研究對象,篩選獲得子3株產生菌株:通過復合誘變獲得了高產菌株,考察了代謝前體、甲基化酶抑制劑以及微生物種間競爭性生長對次生代謝產物的影響,得到了10個混合培養(yǎng)的次級代謝產物,其中一個具有良好的細胞毒活性;通過突變株的規(guī)模化發(fā)酵,獲得