金槍魚頭酶解物免疫活性肽的分離及對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響.pdf

1、金槍魚是名貴海洋魚類，因其營養(yǎng)豐富味道鮮美，一直被公認(rèn)為最理想的健康食品。魚頭是金槍魚產(chǎn)業(yè)化加工下腳料的主要組成部分，其蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成合理，是制備開發(fā)生物活性肽的理想原料。本實(shí)驗(yàn)室長期開展金槍魚頭高值化利用的研究，已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，黃鰭金槍魚頭蛋白酶解液10-5KDa組分具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用。本研究在此基礎(chǔ)上對金槍魚頭蛋白酶解物10-5KDa組分進(jìn)行了營養(yǎng)學(xué)評價(jià)和理化性質(zhì)分析，采用葡聚糖凝膠層析法對免疫活性肽進(jìn)行了分級分

2、離，研究了活性組分對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。旨在尋求免疫活性肽的分級分離條件，為探討其增強(qiáng)免疫作用機(jī)理以及開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　利用超濾法從金槍魚頭蛋白酶解液中制備10-5KDa組分TIP，對TIP的營養(yǎng)學(xué)和理化性質(zhì)進(jìn)行了較系統(tǒng)的分析。TIP的粗蛋白含量高達(dá)86.1％，脂肪含量0.86％，含有人體必需的礦物質(zhì)元素鉀、鈉、鎂、鈣、磷和微量元素鐵、鋅、銅、硒。氨基酸組成合理，總氨基酸含量為5.15g/1

3、00mL，其中必需氨基酸占36.28％，鮮味氨基酸占48.12％。分子量分布結(jié)果顯示TIP中存在多種分子量的片段，其中10～5KDa的組分占27.49％，3.6～1.4KDa之間的占40.93％，1KDa以下有18.20％。采用氮溶指數(shù)(NSI)對TIP的溶解性進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果顯示TIP有著優(yōu)良的溶解性，在pH2～pH12范圍內(nèi)、30～85℃溫度范圍內(nèi)，NSI均達(dá)到0.9以上。TIP乳化性一般，起泡性良好，在蛋白濃度為3％時(shí)，發(fā)泡性達(dá)到最

4、高值為1.60，發(fā)泡穩(wěn)定性偏低，但在pH10時(shí)，顯著增強(qiáng)。
　　采用葡聚糖凝膠Sephadex G-25對TIP進(jìn)行了初步分離，確定了最佳分離條件：柱規(guī)格2.6×60cm流速0.5mL/min，上樣量為20mg/mL×5mL，此條件下TIP可以分為TIP1，TIP2，TIP3，TIP4和TIP5五個(gè)部分。通過小鼠體外脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對分離組分進(jìn)行免疫活性跟蹤，證實(shí)組分TIP3的中劑量(0.2mg/mL)、低劑量(0.01mg/m

5、L)組可顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖(P<0.05)，有較好的活性。對TIP3采用SephadexG-15做進(jìn)一步分離純化，得到三個(gè)洗脫峰，對主要組分TIP3B，TIP3C進(jìn)行氨基酸分析和電噴霧質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示 TIP3B肽含量約占86％，主要由200-1200Da的肽段組成。TIP3C組成成分復(fù)雜，肽含量約占74％，主要由分子量200-800Da的小肽構(gòu)成。經(jīng)脾淋巴細(xì)胞增殖活性測定顯示，TIP3C在濃度為0.05mg/mL時(shí)，可以顯著

6、促進(jìn)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞的增值(P<0.05)。
　　考察了組分TIP3C對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。用MTT比色法和吞噬中性紅法考察了TIP3C對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞代謝活性和吞噬功能的影響；采用Griess法和ELISA法檢測了TIP3C對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示TIP3C高(0.04mg/mL)、中(0.02mg/mL)、低(0.01mg/mL)劑量組均對小鼠