單倍型測序技術(shù)研究及其在K562細胞系中的應(yīng)用.pdf

1、單倍型是單倍體基因型的基因序列中的一部分，包含著一系列位于同一染色體鄰近多個位點上進行共同遺傳的基因。在生物科學(xué)領(lǐng)域中，目前常用的研究手段及基因測序的方法大多數(shù)都是將基因組DNA混合在一起，對其整體進行分析和研究，以染色體對為單位發(fā)現(xiàn)可能存在的突變位點。但是，某些突變有可能只發(fā)生在其中某個染色單體上，這種情況目前還不能夠通過普通的方法加以確定，這就需要對該樣本的單倍型進行檢測和分析。對單倍型的研究可以用于發(fā)現(xiàn)遺傳變異多態(tài)位點，確定人類遺

2、傳的相似性和差異性，了解疾病與基因之間的關(guān)系，為預(yù)防、診斷和治療疾病提供新的方法和思路，從而對人類健康做出貢獻。因此，對單倍型的研究將是一項新的挑戰(zhàn)和機遇。
　　然而，普通的全基因組范圍上的測序手段很難完成對單倍型的研究和確定，已有的許多統(tǒng)計學(xué)或?qū)嶒灧椒m然對人類單倍型進行了探索和分析，但都存在著許多缺點和不足。同時，在單倍型分析研究領(lǐng)域，目前還沒有對腫瘤細胞進行過大量有效的研究。因此，本論文針對以上問題，建立了一種簡便有效的單倍

3、型測序技術(shù)，以人紅白血病細胞系K562細胞基因組DNA為研究對象，通過梯度稀釋基因組DNA至亞單倍型水平，全基因組擴增，以及在Illumina Hiseq測序平臺進行雙端測序等手段對其進行單倍型研究。樣本測序結(jié)果的生物信息分析表明本論文所建立的方案成功地獲得了較高含量的單倍體基因型片段，與普通二倍體測序結(jié)果相比，本文方法能夠得到較多長程的單倍型片段，可以用于后續(xù)完整單倍型的拼接組裝，證明了此單倍型測序技術(shù)在K562腫瘤細胞系中能夠進行有

4、效的分析。此研究結(jié)果也是單倍型測序技術(shù)首次應(yīng)用于腫瘤細胞領(lǐng)域的探索與實踐，為單倍型測序技術(shù)在腫瘤基因組研究中的應(yīng)用做出了基礎(chǔ)性工作。論文的具體研究內(nèi)容為:
　　1.利用數(shù)學(xué)分析軟件MATLAB，根據(jù)單倍型的相關(guān)理論知識，設(shè)計并編寫理想情況下相應(yīng)DNA稀釋的模擬實驗程序，對基因組DNA稀釋至亞單倍型水平后的單倍型片段獲取情況進行計算機模擬。分別討論了經(jīng)由酚-氯仿抽提法和長片段試劑盒法提取出的不同片段長度的DNA稀釋結(jié)果，各自對比了在

5、不同稀釋倍數(shù)下獲得的單倍型片段平均概率特征，綜合分析得到可行的稀釋倍數(shù)（0.1和0.4），為建立具體的單倍型測序方案提供理論依據(jù)。
　　2.在計算機模擬研究得到合適的稀釋倍數(shù)的基礎(chǔ)上，建立以K562細胞基因組DNA為研究對象的單倍型測序技術(shù)，完成包括基因組DNA樣本提取、梯度稀釋至亞單倍型水平、全基因組擴增和看家基因PCR檢驗等實驗及結(jié)果分析，得到三組樣本（其中，2組為原始基因組DNA稀釋至0.1×單倍型、1組為稀釋至0.4×單倍

6、型），通過Illumina Hiseq2000測序平臺得到測序數(shù)據(jù)，并分析數(shù)據(jù)質(zhì)量，獲得初步的測序片段統(tǒng)計結(jié)果。
　　3.利用多種生物信息處理軟件，對測序所得數(shù)據(jù)進行與人類參考基因組(RefSeqHg19)的序列比對、單核苷酸多態(tài)性SNP檢驗、重疊群contig拼接及染色體分布的生物信息分析，得到基因組覆蓋率、平均測序深度、片段拼接質(zhì)量等相關(guān)結(jié)果。對三組樣本的數(shù)據(jù)進行討論，以普通二倍體基因組測序的雜合比率作為評價基準，得到樣本中單