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1、乳品質(zhì)量安全備受關(guān)注,使針對(duì)各種花樣繁多的摻假檢驗(yàn)方法成為乳品質(zhì)量安全控制的關(guān)鍵。本課題運(yùn)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法分析牛乳固有蛋白成分及其含量,獲得了乳源蛋白電泳分析圖譜,并建立了分別以牛β-酪蛋白(β-CN)和β-乳球蛋白(β-Lg)為目標(biāo)蛋白的競(jìng)爭(zhēng)ELISA和間接ELISA檢測(cè)體系,實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛乳固有蛋白的多指標(biāo)定性定量分析。
檢測(cè)牛乳蛋白的SDS-PAGE
2、電泳技術(shù)研究。選用原料牛乳和脫脂牛乳進(jìn)行電泳,采用脫脂牛乳進(jìn)樣,分離膠濃度為17%、濃縮膠濃度為3%的不連續(xù)垂直穩(wěn)流電泳,實(shí)驗(yàn)可以得到比較好的乳蛋白分離分析圖譜。用大豆蛋白粉和牛乳清粉配制系列摻假樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,所得圖譜結(jié)合凝膠圖像分析系統(tǒng)可知:SDS-PAGE可以檢測(cè)出牛乳中摻入的非乳源蛋白(大豆蛋白粉)和乳源蛋白(牛乳清粉),其檢出限分別為0.79%和4.4%。再用市售嬰幼兒乳粉對(duì)所建立的電泳檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)證明
3、電泳技術(shù)是一種直觀、有效的乳蛋白檢測(cè)方法,能夠應(yīng)用于乳及乳品質(zhì)量監(jiān)控。
乳源蛋白質(zhì)的特異性雞卵黃抗體制備。選擇牛β-酪蛋白和β-乳球蛋白2種免疫原分別免疫臨產(chǎn)蛋雞,收集免疫后的高免雞蛋,采用水稀釋法,經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾、鹽析、DEAE FF離子交換、親和色譜等步驟,得到純化IgY樣品(anti-β-CN IgY、anti-β-Lg IgY),其純度高達(dá)90%,每個(gè)卵黃中可獲得100 mg~130 mg的特異性IgY,ELISA效價(jià)
4、(稀釋起始濃度均為1mg/ml)在1:2048~1:4096。anti-β-Lg IgY抗體與其相應(yīng)抗原反應(yīng)特異性良好,但anti-β-CN IgY與β-Lg和大豆蛋白粉交叉反應(yīng)明顯,采用抗體修飾技術(shù)增強(qiáng)其特異性,得到blocked anti-β-CNIgY可用于ELISA檢測(cè)。
兩種乳源蛋白質(zhì)抗原的酶標(biāo)記技術(shù)研究。為建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)體系,選用HRP(辣根過(guò)氧化物酶)通過(guò)過(guò)碘酸鈉氧化法分別標(biāo)記β-酪蛋白和β-乳球蛋白
5、抗原,結(jié)果顯示:過(guò)碘酸鈉氧化法標(biāo)記上述兩種抗原的酶結(jié)合率、標(biāo)記率、克分子比值合適。當(dāng)β-CN-HRP反應(yīng)體系中HRP與IgY的分子個(gè)數(shù)比為1:1時(shí),標(biāo)記效果最好(克分子比值0.11,結(jié)合率23.9%,標(biāo)記率85.4%),而在β-Lg-HRP反應(yīng)體系中,HRP與IgY的分子個(gè)數(shù)比為1.5:1時(shí),標(biāo)記效果最好(克分子比值0.05,結(jié)合率23.9%,標(biāo)記率60.9%),所制得的酶標(biāo)抗原的效價(jià)最高均可達(dá)1:640(酶標(biāo)抗原起始濃度1mg/ml)
6、。
建立了以β-酪蛋白為目標(biāo)蛋白的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。確定了包被抗體最佳濃度(antl-β-CN IgY1:60)、封閉液及封閉時(shí)間(1%明膠的PBST,封閉1h)、酶標(biāo)抗原(1:20)和待測(cè)牛乳樣品(1:80)稀釋液與抗體作用時(shí)間(60min)、底物最佳反應(yīng)時(shí)間(20min,37℃)等對(duì)競(jìng)爭(zhēng)ELISA效果有重要影響的因素,完成了檢測(cè)抗原β-酪蛋白競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)可在2小時(shí)內(nèi)完成。
實(shí)驗(yàn)證明β
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