乳酸乳球菌中冷應(yīng)激蛋白的表達(dá)及其抗凍保護(hù)作用.pdf

1、乳酸菌在食品工業(yè)中扮演者重要角色，參與許多個(gè)發(fā)酵過程。作為牛乳中檢出率最高的菌——乳酸乳球菌(L．lactis subsp．1actis)，有較強(qiáng)的產(chǎn)酸力及蛋白質(zhì)分解能力，對(duì)多種鏈球菌、葡萄球菌、芽孢菌、乳桿菌有抑制作用。在干酪、發(fā)酵奶油、奶酪的發(fā)酵劑中經(jīng)常使用。因此對(duì)其發(fā)酵后冷卻及冷凍保藏過程中的存活率的研究至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)有很多機(jī)構(gòu)和學(xué)者是從研究保護(hù)劑等外部條件的保護(hù)作用的角度出發(fā)，而對(duì)乳酸菌自身抵抗環(huán)境變化的保護(hù)機(jī)制研究較少。

2、 有一明顯現(xiàn)象大多數(shù)微生物(包括乳酸菌)都能適應(yīng)比其最佳生長(zhǎng)溫度低得多的低溫環(huán)境，誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列分子質(zhì)量7kDa左右的蛋白質(zhì)，這一系列蛋白質(zhì)被稱為冷應(yīng)激蛋。白，它們一般由68到74個(gè)氨基酸構(gòu)成，都存在5個(gè)反平行B折疊股的B桶狀片層結(jié)構(gòu)。它們的主要功能是作為RNA分子伴侶(RNA chaperone)與mRNA結(jié)合，阻止mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，促進(jìn)翻譯。 本課題主要針對(duì)乳酸乳球菌中冷應(yīng)激蛋白。研究了不同冷處理?xiàng)l件下冷誘導(dǎo)蛋白

3、產(chǎn)生及對(duì)菌體抗凍特性的影響，并通過NICE系統(tǒng)高效表達(dá)冷應(yīng)激蛋白CspC、CspD基因，進(jìn)一步證實(shí)了CSPs的作用。課題主要分為以下幾部分： 1．通過Arrhenius的建立，確定了對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種KLDS4.013冷處理的兩個(gè)溫度區(qū)間，分別為：28℃～13℃之間和小于13℃。 2．10℃保持4h的冷處理，使菌體凍融存活率較未處理的空白樣增加了200倍以上，而加入氯霉素的對(duì)照組存活率接近于或低于未處理的空白樣。初步推

4、斷可能是氯霉素抑制了某種蛋白合成，而這種新合成的蛋白在低溫條件下被誘導(dǎo)表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞，使菌體獲得抗凍特性。 3．通過SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)冷處理樣有兩條分子量為分子量分別為7.3、6.1kDa的蛋白，初步確定為冷應(yīng)激蛋白。 4．利用PCR技術(shù)獲得乳酸乳球菌乳酸亞種KLDS4.013中冷應(yīng)激蛋白CspC、CspD的基因片段。 5．利用NICE系統(tǒng)高效表達(dá)冷應(yīng)激蛋白CspC、CspD基因并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-P

5、AGE電泳分析，得出CspC、CspD的相對(duì)分子量分別為7、6.2kDa。 6．為了確定冷應(yīng)激蛋白CspC、CspD的作用，做了三個(gè)實(shí)驗(yàn)：1)測(cè)定30 ℃菌體的生長(zhǎng)曲線；2)菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期中期(OD<,600>=0.8)，轉(zhuǎn)至7℃培養(yǎng)，測(cè)定低溫刺激對(duì)菌體生長(zhǎng)影響；3)測(cè)定4個(gè)循環(huán)的凍-溶試驗(yàn)的活菌數(shù)。通過空白菌株與重組菌株的比較，可以得出：CspC使菌體更加迅速的恢復(fù)了生長(zhǎng)；冷應(yīng)激蛋白CspD增強(qiáng)了菌體的抗凍存活率(增加了30