瑞氏木霉QM9414在不同碳源條件下動(dòng)態(tài)酶譜及胞外蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、隨著全球能源消費(fèi)的日益遞增，石油等化石能源持續(xù)消耗，人類社會(huì)正面臨著能源危機(jī)以及日益嚴(yán)峻的環(huán)境問(wèn)題，大力發(fā)展生物質(zhì)能源可望為解決能源短缺的難題做出貢獻(xiàn)。木質(zhì)纖維素作為可再生的生物質(zhì)是能夠被轉(zhuǎn)化為液體燃料，并且成本低廉可用性強(qiáng)等特點(diǎn)，被認(rèn)為是生產(chǎn)生物燃料的理想原料。然而，由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成分多樣，以及其各組成成分（纖維素、半纖維素，以及木質(zhì)素）間常交鏈成復(fù)雜的超分子結(jié)構(gòu)，形成了生物質(zhì)抗降解的屏障，致使無(wú)論是原核的細(xì)菌還是真核的絲狀

2、真菌，都難以對(duì)其進(jìn)行高效的降解。由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜層次性強(qiáng)，其降解所需要的酶的種類也眾多，包括纖維素降解酶系，半纖維素降解酶系，果膠降解酶系以及一些和降解相關(guān)的輔助蛋白。瑞氏木霉于2008年獲得全基因組測(cè)序，從基因組的分析顯示共有200個(gè)基因編碼糖苷水解酶，其中有10個(gè)基因編碼熟悉的纖維素酶（2個(gè)外切纖維素酶，5個(gè)內(nèi)切纖維素酶），16個(gè)基因編碼半纖維素酶，103個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶。由此可見(jiàn)不僅木質(zhì)纖維素的組成復(fù)雜，其降解所需的酶也很復(fù)雜，

3、要徹底高效的降解木質(zhì)纖維素，了解真菌降解過(guò)程中各種酶的組合以及分泌的次序性才是關(guān)鍵。因此，本文探究降解酶系的分泌是否隨底物的種類，濃度的不同而發(fā)生變化。酶分子等蛋白質(zhì)分子之間在分泌次序上是否有相關(guān)性。本論文對(duì)瑞氏木霉菌株QM9414在不同碳源條件下（單糖，二糖，木聚糖，秸稈麩皮）的動(dòng)態(tài)酶譜以及產(chǎn)物譜進(jìn)行了分析，對(duì)不同條件下蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)分析，并取得了以下新的研究結(jié)果。
　　1.建立了展示胞外酶

4、系動(dòng)態(tài)酶譜及其產(chǎn)物譜的研究技術(shù)方法
　　通過(guò)胞外酶系活性測(cè)定與Native-PAGE酶譜技術(shù)相結(jié)合，將粗酶液中胞外酶系酶活的高低在一維時(shí)間上的動(dòng)態(tài)變化表征過(guò)渡到不同糖苷酶種類隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)表征，特別是展示了不同同工酶的表達(dá)分泌差異，使胞外酶系分析更為精細(xì)。該方法與終點(diǎn)法測(cè)定粗酶液酶活大小相比，胞外動(dòng)態(tài)酶譜技術(shù)不僅能夠反映酶系總酶活的變化，而且還能反映酶系中同工酶的種類以及其含量的動(dòng)態(tài)變化情況。FACE電泳（熒光輔助糖電泳）對(duì)比溶液中

5、還原糖中總糖的量的測(cè)定方法不僅可反映還原糖的總量的變化更能區(qū)分不同系列寡糖的隨時(shí)間濃度的時(shí)序性變化情況，這就為下一步不同碳源及濃度下胞外蛋白酶譜及產(chǎn)物譜的相關(guān)性分析奠定了基礎(chǔ)。
　　2.分批發(fā)酵培養(yǎng)條件下不同碳源時(shí)胞外糖苷水解酶酶譜及其產(chǎn)物譜的動(dòng)態(tài)分析
　　通過(guò)Native-PAGE電泳技術(shù)與FACE電泳技術(shù)相結(jié)合，對(duì)酶譜與產(chǎn)物譜的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明1％的葡萄糖和1％木糖發(fā)酵5天并不能誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生，1％乳糖具有較

6、強(qiáng)的誘導(dǎo)能力，在發(fā)酵第2天就有纖維素酶和木聚糖酶的分泌。1％纖維二糖沒(méi)有纖維素酶和木聚糖酶的分泌，產(chǎn)物譜分析發(fā)現(xiàn)其能被β-葡萄糖苷酶降解成葡萄糖從而產(chǎn)生碳代謝阻遏的抑制。1％木聚糖誘導(dǎo)能力較強(qiáng)，高于乳糖的誘導(dǎo)能力，CMC酶活較乳糖提高了15％，木聚糖酶酶活提高了了2倍。產(chǎn)物譜分析顯示發(fā)酵過(guò)程有大量的木寡糖產(chǎn)生，木寡糖可能是強(qiáng)誘導(dǎo)物。秸稈麩皮作為天然的生物質(zhì)，在發(fā)酵5天的過(guò)程中，結(jié)合產(chǎn)物譜和酶譜的分析顯示，發(fā)酵初期第1天產(chǎn)生少量的可溶性糖

7、成分，誘導(dǎo)出少量的酶組分，第2天培養(yǎng)基中檢測(cè)到酶解產(chǎn)生的大量高聚合度的寡糖，到第3天這些寡糖誘導(dǎo)出大量的內(nèi)切纖維素酶和木聚糖酶。結(jié)晶纖維素PH105為碳源時(shí)未誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生，但是當(dāng)PH105分別和乳糖以及木聚糖混合后，混合碳源的誘導(dǎo)能力大大提高，酶活分別較單純?nèi)樘翘岣吡私?倍，單純木聚糖條件下提高了近0.5倍。產(chǎn)物譜分析顯示組合碳源的寡糖成分有所增加，其原因?yàn)槿樘腔蚰揪厶菫樘荚磿r(shí)誘導(dǎo)的纖維素酶類降解PH105后產(chǎn)生大量的纖維寡糖，從

8、而導(dǎo)致組合碳源誘導(dǎo)的酶活高于單一碳源條件下的酶活。
　　3.分批發(fā)酵培養(yǎng)條件下不同碳源胞外蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　酶譜只跟蹤了纖維素酶和木聚糖酶的變化情況，并未跟蹤所有與木質(zhì)纖維素降解有關(guān)蛋白質(zhì)的分泌變化，因此運(yùn)用orbitrip質(zhì)譜技術(shù)對(duì)不同碳源條件下胞外蛋白的分泌情況及秸稈麩皮條件下胞外蛋白隨時(shí)間的變化進(jìn)行了分析。甘油作為基礎(chǔ)碳源不具有誘導(dǎo)作用，因此以1％甘油作為對(duì)照碳源。1％乳糖、1％木聚糖、1％秸稈麩皮四種碳源條件下，秸

9、稈麩皮為碳源的條件下纖維素降解酶類的分泌總量遠(yuǎn)高于其它三種蛋白，乳糖和木聚糖誘導(dǎo)的蛋白總量相差不大，但分泌總量遠(yuǎn)小于秸稈麩皮。三種碳源條件下酶類組成成分差距很大。乳糖主要誘導(dǎo)降解纖維素的酶類，如外切纖維素酶(CBH1，CBH2)和內(nèi)切纖維素酶(Egl1，Egl3，Egl4，Egl5)。木聚糖為碳源的條件下，主要誘導(dǎo)降解半纖維素的酶類大量分泌（如木聚糖酶，乙酰木聚糖酯酶，木糖苷酶），降解纖維素的酶類分泌量很少。由于秸稈和麩皮成分最為復(fù)雜，

10、因此降解所需的纖維素酶，半纖維素酶都有所分泌，且比較平均。
　　秸稈麩皮為碳源條件下，胞外酶系的表達(dá)具有次序性，蛋白分泌總量隨時(shí)間依次增加。在降解前期48h-72h，外切纖維素酶(CBH1，CBH2)都是主要的降解酶類且隨著時(shí)間分泌量逐漸增加，且外切纖維素酶的分泌量在整個(gè)酶系中所占比列最大。到降解后期96h-120h，降解半纖維素的木聚糖酶（XYN2，XYN3）、乙酰木聚糖酶酯酶、木葡聚糖酶的分泌量逐漸增加。由此可見(jiàn)瑞氏木霉分泌的

11、游離酶系可以滲透到纖維素的內(nèi)部進(jìn)行降解。降解初期伴隨著少量的半纖維素降解酶的分泌，產(chǎn)生大量的寡糖，繼而誘導(dǎo)大量的半纖維素降解酶的分泌。在木質(zhì)纖維素整個(gè)降解過(guò)程中，瑞氏木霉能夠徹底降解纖維素，不能徹底降解半纖維素，只具備降解半纖維素骨架的木聚糖酶、木葡聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶，缺少降解半纖維素側(cè)鏈所需的酶類。因此，瑞氏木霉對(duì)于木質(zhì)纖維素的降解是不徹底的，通過(guò)對(duì)纖維素酶系各自轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)的分析，我們發(fā)現(xiàn)纖維素酶分泌量可能