DNA2和TATDN1在細(xì)胞核和線粒體內(nèi)的功能及調(diào)控.pdf

1、DNA2是一種核酸酶/解旋酶，首先在酵母中被發(fā)現(xiàn)。作為重要的工具酶在DNA復(fù)制和修復(fù)中，參與不同的信號通路。例如在岡崎片段成熟過程中能夠去除RNA引物，雙鏈DNA斷裂修復(fù)中進(jìn)行末端剪切，以及最近報道的，DNA2能夠穩(wěn)定并重新起始雞爪狀復(fù)制叉。2008年，我們實驗室首先發(fā)現(xiàn)人DNA2也具有保守的核酸酶和解旋酶結(jié)構(gòu)域，但是缺少經(jīng)典的核定位信號肽序列。所以免疫熒光和蛋白雜交實驗表明，人DNA2主要定位在線粒體內(nèi)而非細(xì)胞核內(nèi)。體外生化實驗表明，

2、人DNA2能夠移除線粒體DNA復(fù)制過程中形成的RNA引物并促進(jìn)polγ合成DNA的效率。此外，人DNA2也能夠參與長片段堿基切除修復(fù)過程中翼狀結(jié)構(gòu)的移除，從而穩(wěn)定極易受到氧自由基攻擊的線粒體DNA。與上述結(jié)果一致，2013年，我們與一個意大利實驗室合作共同報道，一些家族性肌無力肌病患者樣本中攜帶有幾個DNA2基因的突變位點，這些位點在氨基酸水平上都是非常保守的。我們表達(dá)并純化這些突變體，體外實驗分析發(fā)現(xiàn)，它們具有核酸酶或者解旋酶缺陷。因

3、此，我們推測DNA2突變很可能直接或間接導(dǎo)致線粒體肌病。
　　本文通過基因靶向技術(shù)構(gòu)建了DNA2敲除小鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的DNA2純和敲除小鼠都是胚胎致死的，說明DNA2對于胚胎發(fā)育是必須且至關(guān)重要的，但是DNA2雜合敲除是可以存活的。讓我們驚訝的是，雖然小鼠DNA2的入核信號序列也全部丟失，但是，DNA2雜合敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的端粒復(fù)制缺陷，例如端粒丟失，端粒斷裂以及姐妹端粒互聯(lián)等。體外實驗表明，DNA2可以特異切割由端粒特

4、殊重復(fù)序列TTAGGG形成的G4四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，并且用G4結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑處理MEF細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，這種G4結(jié)構(gòu)在DNA2雜合敲除小鼠MEF細(xì)胞中更加穩(wěn)定。此外，DNA2缺失會導(dǎo)致端粒損傷和染色體分離錯誤，從形成多倍體細(xì)胞。并且在DNA2雜合敲除小鼠癌癥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量功能紊亂的端粒。翻譯后修飾對于蛋白的功能調(diào)節(jié)起到重要的作用。有報道稱，酵母DNA2的磷酸化可以招募DNA2到損傷位點進(jìn)行DNA修復(fù)，但是關(guān)于哺乳動物DNA2的翻譯后修飾還鮮有研究。當(dāng)DNA

5、受到損傷時，修復(fù)相關(guān)的蛋白被激活并富集到損傷位點進(jìn)行DNA修復(fù)。本文研究了DNA2的泛素化，數(shù)據(jù)表明，DNA2與E3連接酶相互作用并被其泛素化（多聚泛素化），泛素化后的DNA2十分穩(wěn)定不被蛋白酶體降解，并且我們推測，泛素化的DNA2能夠幫助DNA2轉(zhuǎn)運到核內(nèi)進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。斑馬魚TATDN1(zTATDN1)具有內(nèi)切核酸酶活性。體外生化分析，zTATDN1能夠切割雙鏈環(huán)狀DNA，形成DSB。這種生化活性使得zTATDN1能夠解離纏繞