重組人ADAM15去整合素結(jié)構(gòu)域蛋白的制備及其作用機(jī)理.pdf

1、ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)是一類(lèi)含有七個(gè)功能結(jié)構(gòu)域并在細(xì)胞間相互識(shí)別和相互作用中發(fā)揮重要作用的跨膜糖蛋白家族。ADAM15作為該家族唯一在去整合素結(jié)構(gòu)域(disintegrin)含有RGD(Arg-Gly-Asp)基序的成員，在細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞粘附、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤的病理變化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是其抗腫瘤機(jī)理需進(jìn)一步闡釋。本文在成功獲取高表達(dá)水平的重組人ADAM15去整

2、合素結(jié)構(gòu)域蛋白片段(rhddADAM15)的基礎(chǔ)上，以小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)為研究模型，研究thddADAM15對(duì)B16細(xì)胞體外增殖、粘附和遷移等細(xì)胞行為的影響，通過(guò)篩選rhddADAM15特異結(jié)合的12肽以及rhddADAM15在B16細(xì)胞上相互作用的靶點(diǎn)蛋白，探討rhddADAM15干預(yù)腫瘤細(xì)胞行為的生理機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　 1)為獲得大量具有生物活性的rhddADAM15蛋白，在詳盡分析目標(biāo)蛋白的cDNA序列

3、的基礎(chǔ)上，(1)選擇能為大腸桿菌稀有密碼子提供額外tRNA的大腸桿菌Escherichia coliRosetta(DE3)作為宿主菌，將目標(biāo)蛋白以GST(Glutathione-S-transferase)融合蛋白形式表達(dá)，在最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下融合蛋白GST-ADAM15濃度為298 mg/L，最佳凝血酶酶切條件下，rhddADAM15濃度為42 mg/L；(2)采用PCR體外定點(diǎn)突變技術(shù)將凝血酶識(shí)別序列附近稀有密碼子GGA(Gly)

4、替換為GGC，同時(shí)消除Pro-Glu-Phe殘基，構(gòu)建突變表達(dá)質(zhì)粒，提高凝血酶酶切效率。在相同的表達(dá)和酶切條件下獲得GST-△-ADAM15和rhddADAM15蛋白濃度分別為326 mg/L和68mg/L，比野生型分別提高9.4%和61.9%。這一結(jié)果表明，在充分認(rèn)識(shí)目標(biāo)蛋白特性的基礎(chǔ)上定向選擇表達(dá)宿主并改造表達(dá)質(zhì)粒能實(shí)現(xiàn)外源蛋白高水平表達(dá)；
　　 2)采用MTT法測(cè)定rhddADAM15對(duì)B16、MCF-7/W以及HMEC-

5、1細(xì)胞體外增殖的作用，采用創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)、Matrigel基質(zhì)膠以及Transwell侵襲小室法觀察rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞體外遷移、粘附和侵襲的影響：采用臺(tái)盼藍(lán)染色法分析細(xì)胞活力、流式細(xì)胞儀檢測(cè)rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明rhddADAM15對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)均有一定的抑制作用(其IC50分別為9.5、11.8和14.9μg/mL)，且明顯抑制B16細(xì)胞的體外增殖、遷移、粘附和侵襲。臺(tái)盼藍(lán)染色法

6、表明低劑量的rhddADAM15并不能導(dǎo)致B16細(xì)胞出現(xiàn)壞死，且rhddADAM15并不導(dǎo)致B16細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡峰，而是將細(xì)胞阻滯于G2/M期，并且這種作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系；
　　 3)采用親和甄別磁珠技術(shù)篩選rhddADAM15在B16細(xì)胞上的結(jié)合蛋白。將rhddADAM15采用蛋白生物素化方法標(biāo)記生物素，借助生物素-親和素系統(tǒng)，將生物素化的rhddADAM15固定于親和素標(biāo)記的免疫磁珠。從B16細(xì)胞裂解液中釣出與之相互作用

7、的蛋白，經(jīng)濃縮富集后，采用雙向電泳分離技術(shù)分離獲得主要的結(jié)合蛋白點(diǎn)，然后對(duì)這些蛋白點(diǎn)進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)分析，在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，共鑒定了8個(gè)蛋白質(zhì)，按功能可分為如下三類(lèi)：(1)臨床應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物(蘋(píng)果酸脫氫酶、磷酸甘油醛脫氫酶和谷氨酸脫氫酶)；(2)能量代謝相關(guān)蛋白(烯醇酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、原肌球蛋白和血紅蛋白)；(3)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成員(p38MAPK激酶)等。在此基礎(chǔ)上通過(guò)分子對(duì)接軟件molsoft ICM模擬計(jì)

8、算獲得rhddADAM15與p38激酶相互作用的最佳模式和重要的結(jié)合位點(diǎn)；
　　 4)采用噬菌體展示技術(shù)篩選與rhddADAM15特異性相互作用的多肽序列。采用噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)對(duì)固定有rhddADAM15的親和磁珠系統(tǒng)進(jìn)行生物淘洗，獲得4條與rhddADAM15特異結(jié)合的12肽。將獲得的12肽與蛋白質(zhì)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如Cdc25和p53，信號(hào)通路相關(guān)蛋白/受體，如整合素αvβ3的胞外區(qū)，絲裂原活化蛋白激酶p

9、38α等與所獲得的4條12肽具有高度同源性；
　　 5)基于上述研究所獲得的rhddADAM15在B16細(xì)胞上潛在的靶點(diǎn)蛋白，進(jìn)一步研究rhddADAM15與p38MAPK激酶的體外相互作用，結(jié)合rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞行為的抑制作用，采用蛋白點(diǎn)雜交和激酶活性測(cè)定方法分析rhddADAM15在體外與重組p38激酶蛋白的結(jié)合情況，同時(shí)研究不同劑量rhddADAM15對(duì)B16細(xì)胞中p38MAPK激酶磷酸化水平的影響，并觀察r

10、hddADAM15對(duì)p38激酶活性受到部分抑制的B16細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期抑制作用的變化。發(fā)現(xiàn)：(1)rhddADAM15在離體低溫條件下能夠和重組p38激酶蛋白結(jié)合，但rhddADAM15(0-10μg/mL)在體外對(duì)p38MAPK激酶活性沒(méi)有影響；(2)同樣劑量的rhddADAM15作用于B16細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中p38MAPK激酶的磷酸化水平提高(被激活)；(3)p38激酶的特異性抑制劑SB203580(0.5 mmol/L)預(yù)