構建RNA結合蛋白表達文庫并研究其在信號轉導中的調控機制.pdf

1、轉化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β或者TGF-β）作為一種重要的細胞因子在細胞的生長、增殖、分化中發(fā)揮著非常重要的調控作用。因此，TGF-β信號通路的調控異常與人類多種疾病密切相關如癌癥等。在TGF-β信號傳遞過程中Smads蛋白發(fā)揮了重要的作用。Smads家族蛋白根據其結構和功能可以分為三大類，分別是受體激活的R-Smads（如Smad2/3），通用轉導的Co-Smad，以及抑制型的I-Smad

2、s。在經典的TGF-β信號通路中，配體與細胞表面的受體結合，從而引起R-Smads的磷酸化。磷酸化的R-Smads與Co-Smad結合形成三聚體進入細胞核，結合到特定的DNA序列從而調控下游基因的表達。
　　在TGF-β信號通路中，轉錄水平的研究已經比較清楚，但是轉錄后水平的調控機制還不是非常清晰?；蛟谵D錄后，需要經過剪接加工成為成熟的mRNA，最后翻譯成為蛋白質。經典的轉錄后剪接加工調控主要是通過RNA結合蛋白識別mRNA上的

3、增強或抑制單元來實現(xiàn)的。在TGF-β信號通路中，RNA結合蛋白如何參與其轉錄后調控的機制還不清晰。本研究擬以構建RNA結合蛋白文庫為載體，結合細胞水平和分子水平的實驗，研究RNA結合蛋白在TGF-β信號通路中的調控作用。
　　根據RNA結合蛋白數據庫中的信息，在人類細胞中有235個蛋白含有一個或多個RNA結合單元（RNA Recognition Motif或者RRM）。對照cDNA文庫(HumanORFeome5.1)，我們獲得了

4、112個RNA結合蛋白的cDNA。通過Gateway系統(tǒng)，我們將文庫中的cDNA成功構建到慢病毒載體上，并在293T細胞中進行了表達檢測，其中86個可以正確表達蛋白。然后我們利用TGF-β熒光素酶報告系統(tǒng)SBE-luc在HaCaT細胞中進行初步篩選并發(fā)現(xiàn)調控TGF-β多個重要蛋白。我們圍繞其中一個蛋白RBP75進行了深入研究，實驗證實RBP75可以促進TGF-β信號通路，從而促進細胞發(fā)生上皮細胞-間充質細胞轉化(Epithelial M