帶魚下腳料蛋白酶水解物亞鐵螯合修飾及其抑菌機(jī)理研究.pdf

1、本研究以帶魚下腳料為原料，采用復(fù)合酶水解技術(shù)制備帶魚下腳料水解液，通過亞鐵離子螯合修飾制備帶魚下腳料多肽亞鐵螯合物，并對(duì)其抑菌特性初步研究，通過凝膠層析、高效液相及聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行對(duì)其有效抑菌成分進(jìn)行分離純化和鑒定，并對(duì)其抑菌特性、抗氧化特性和抑菌機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)研究。 在帶魚下腳料蛋白分離特性研究中，主要進(jìn)行了帶魚下腳料蛋白質(zhì)的分離和氨基酸成分檢測。結(jié)果表明：帶魚下腳料濕基蛋白質(zhì)含量為16.44%，干基蛋白質(zhì)含量為78.3

2、6%，蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及脂肪含量均較為豐富，極具開發(fā)潛力；帶魚下腳料蛋白中含有18種氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸等呈昧氨基酸含量占總氨基酸含量的57.70%；帶魚下腳料蛋白由堿溶性蛋白、堿不溶性基質(zhì)蛋白、肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和非蛋白氮構(gòu)成，各蛋白組分分子量大小依次為：肌漿蛋白>堿溶性蛋白>肌原纖維蛋白>非蛋白氮；帶魚下腳料中基質(zhì)蛋白含量最高，為75.83%，其次是堿溶性蛋白質(zhì)，占16.31%；肌原纖維蛋白含量為3.60%

3、；肌漿蛋白含量最低，為2.15%；帶魚下腳料蛋白中氨基酸總量較高，但必需氨基酸尤其是賴氨酸含量不足，是一種低質(zhì)蛋白質(zhì)，表明帶魚下腳料不適于制作食品而適合制作天然海鮮調(diào)味料。 通過對(duì)動(dòng)物復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味酶以及由兩者組成的復(fù)合酶最適作用條件的正交優(yōu)化確立了最適水解條件，復(fù)合酶最適水解條件為：帶魚下腳料用量4.1g/100mL，溫度40℃，復(fù)合比1：1，酶濃度6×103IU/100mL·pH值7.0。同單種酶水解條件相比，采用復(fù)合酶水

4、解時(shí)底物濃度提高，而酶濃度顯著降低，復(fù)合酶水解效果明顯優(yōu)于單種酶；復(fù)合酶與帶魚下腳料的混濁液pH值接近于最適水解pH值，省略pH值調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)；采用復(fù)合酶對(duì)未脫脂帶魚下腳料進(jìn)行水解，水解度隨時(shí)間的變化存在線性關(guān)系，可表達(dá)為y=5.3451n（x）+2.637，R2＝0.990；采用復(fù)合酶對(duì)脫脂帶魚下腳料進(jìn)行水解，水解度隨時(shí)間的變化也存在線性關(guān)系，可表達(dá)為y=0.807x+1.125，R2＝0.992。在以制備低水解度活性多肽目的前提下，采用

5、未脫脂帶魚下腳料為原料達(dá)到相同水解度所需時(shí)間少于脫脂帶魚下腳料，采用未脫脂帶魚下腳料為原料可節(jié)約大量有機(jī)溶劑，安全性高，水解后帶魚脂肪以魚油形式存在于水解液表面，分離十分簡便，因此帶魚下腳料水解時(shí)無需進(jìn)行脫脂。 通過多肽亞鐵螯合物制備條件研究發(fā)現(xiàn)：帶魚下腳料多肽亞鐵螯合物制備中水解液水解度、最適pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、抗氧化劑種類及用量等參數(shù)與前人研究成果既存在相似之處也存在不同點(diǎn)。本研究中多肽亞鐵螯合物的最佳制備工藝為：水

6、解度6%、pH值7.0、異抗壞血酸0.1%、反應(yīng)時(shí)間20min和反應(yīng)溫度20℃，在上述條件下亞鐵離子螯合率最高；通過對(duì)所制備的多肽亞鐵螯合物進(jìn)行紫外掃描以及螯合物定性檢測發(fā)現(xiàn)：帶魚下腳料水解液經(jīng)亞鐵離子螯合修飾后生成了新的物質(zhì)，即生成多肽亞鐵螯合物，但所制備的多肽亞鐵螯合物中含有少量未螯合的多肽，需要進(jìn)一步分離純化。 通過對(duì)不同體積水解液制備所得多肽亞鐵螯合物的抑菌活性研究表明：以50mL水解液經(jīng)亞鐵離子螯合后離心所得上清液制備

7、的多肽亞鐵螯合物抑菌活性最高；超濾實(shí)驗(yàn)表明由分子量大于5000Da多肽制備的多肽亞鐵螯合物抑菌效果較好；實(shí)驗(yàn)以引起食品腐敗的主要微生物為研究對(duì)象，首次對(duì)多肽亞鐵螯合物的抗菌譜進(jìn)行了研究，同時(shí)研究了pH值、溫度、金屬離子、蛋白酶、抑菌中濃度EC50以及空間環(huán)境對(duì)多肽亞鐵螯合物抑菌活性的影響。結(jié)果表明：多肽亞鐵螯合物在中性偏酸性范圍內(nèi)（pH值6.0～7.0）抑菌效果較好：高溫對(duì)多肽亞鐵螯合物抑菌活性影響較大；食品中常見的鈉離子對(duì)多肽亞鐵螯合

8、物抑菌活性影響較小，而高濃度鈣離子則對(duì)其抑菌活性影響較大；蛋白酶對(duì)多肽亞鐵螯合物抑菌活性影響顯著，經(jīng)蛋白酶處理后多肽亞鐵螯合物抑菌活性基本完全喪失；抑菌中濃度EC50實(shí)驗(yàn)表明，多肽亞鐵螯合物對(duì)不同微生物的抑菌效果不同，其中對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌和沙門氏菌均有較強(qiáng)的抑制作用，多肽亞鐵螯合物抑菌中濃度EC50較高，這與其未進(jìn)行分離純化有關(guān)；多肽亞鐵螯合物暴露于開放空間后僅發(fā)生明顯吸潮現(xiàn)象，但吸潮后仍不能被環(huán)境微生物利用，對(duì)

9、環(huán)境中存在的多種微生物均有較強(qiáng)的抗降解能力。 多肽亞鐵螯合物通過葡聚糖凝膠Sephadex-25和Sephadex-75兩次分離純化后得到一種抑菌活性較高的多肽亞鐵螯合純化物，并經(jīng)高效液相色譜梯度洗脫檢測為單一組分：SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳表明多肽亞鐵螯合純化物分子量約為26kDa；同分離純化前相比，經(jīng)分離純化后所得的多肽亞鐵螯合純化物抑菌活性顯著提高，對(duì)大部分供試菌種的最低抑菌濃度MIC為1%，純化物對(duì)大腸桿菌、金黃

10、色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌和沙門氏菌抑制效果較好，最低抑菌濃度均為0.5%；通過回歸分析計(jì)算，當(dāng)多肽亞鐵螯合純化物用量為500mg時(shí)，其半衰期t0.5為38.18h；多肽亞鐵螯合物不同純化組分抑菌活性同其鐵含量有關(guān)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)鐵含量越高，抑菌活性越弱，同時(shí)亞鐵離子修飾對(duì)于帶魚下腳料水解多肽是否具有抑菌活性有直接關(guān)系；抗氧化實(shí)驗(yàn)證實(shí)：多肽亞鐵螯合物對(duì)羥自由基有一定清除效果，而對(duì)過氧化氫清除效果不明顯，對(duì)油脂也有一定抗氧化效果，且抗氧化效果接近

11、維生素E；多肽亞鐵螯合純化物元素組成為：C，34.47%；H，5.92%；N，5.50%；O，49.86%； Fe，2.55%，元素組成符合多肽亞鐵螯合物主要元素成分，多肽亞鐵螯合純化物為氨基酸和鐵元素共同構(gòu)成。紅外光譜分析表明多肽亞鐵螯合純化物中的亞鐵離子與氨基和羰基通過單齒共價(jià)鍵牢固結(jié)合在一起，并提出了多肽亞鐵螯合純化物的初步構(gòu)象。 利用攝影顯微鏡及透射電鏡技術(shù)研究了多肽亞鐵螯合純化物對(duì)大腸桿菌（Escherichia co

12、ll）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的生長形態(tài)及細(xì)胞壁等微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明：多肽亞鐵螯合物對(duì)微生物的作用可能是通過作用于革蘭氏陽性菌和陰性菌外膜表面形成內(nèi)外連通的孔道，造成菌體細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，細(xì)胞壁破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡；同時(shí)由于多肽亞鐵螯合物不同組分抑菌活性同其鐵含量成負(fù)相關(guān)，推測多肽亞鐵螯合物抑菌機(jī)理同乳鐵蛋白類似，也有同微生物存在競爭性結(jié)合鐵元素，從而抑制微生物正常生長繁殖的功效。多肽亞鐵螯合物同時(shí)存在