動(dòng)物源性食品中氯霉素快速檢測(cè)的ELISA方法研究.pdf

1、氯霉素（CAP）是一種高效的抗生素，它可以和大多數(shù)藥物和飼料添加劑混用，在使用過(guò)程中穩(wěn)定，藥效不會(huì)降低。由于該藥物的廣泛使用，使其在動(dòng)物源性食品中的檢出率越來(lái)越高，許多發(fā)達(dá)國(guó)家相繼禁止或嚴(yán)格限制使用氯霉素，但傳統(tǒng)的氯霉素殘留分析方法需要昂貴的儀器和專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員，且周期長(zhǎng)、成本高，不能滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)和快速檢測(cè)的要求，建立高效、靈敏、經(jīng)濟(jì)的氯霉素殘留分析方法是很有必要的。因此，研究用于檢測(cè)氯霉素的ELISA試劑盒用于食品安全檢測(cè)，對(duì)于保護(hù)消費(fèi)者利

2、益，以及在國(guó)際貿(mào)易中有重要的意義。
　　 本研究對(duì)氯霉素人工抗原的合成、抗體的純化以及ELIsA檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化等進(jìn)行了研究。
　　 采用活性酯法和重氮化法，將半抗原氯霉素與小牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)，經(jīng)紫外光譜、紅外光譜、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定證明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。
　　 運(yùn)用合成的免疫原（Hap-BSA）多次免疫動(dòng)物，采集抗血清，制備出氯霉素多克隆抗體，經(jīng)ELISA

3、法測(cè)定抗體效價(jià)可達(dá)到1：1000000。采用飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)采集的抗血清進(jìn)行初級(jí)分離，后利用自制的免疫親和層析柱對(duì)IgG粗品進(jìn)一步進(jìn)行親和層析純化，可獲得高純度高特異性的兔抗氯霉素抗體。
　　 通過(guò)比較不同的酶標(biāo)記方法，選用混合酸酐法合成酶標(biāo)半抗原，并用ELISA法確定了偶聯(lián)后HRP的活性。通過(guò)對(duì)包被緩沖液、洗滌次數(shù)、包被溫度、時(shí)間、減少非特異性吸附的方法等的篩選，優(yōu)化了固相抗體-酶標(biāo)抗原直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法。確定以0

4、.05mol/L pH9.6的CBS緩沖液作為包被酶標(biāo)板的抗體稀釋緩沖液，以0.01mol/L pH7.4 PBS溶液作為酶標(biāo)抗原的稀釋液，以1.0％OVA的PBS溶液作為封閉液，固相包被條件為37℃2h最佳。
　　 利用優(yōu)化后的分析條件和酶標(biāo)半抗原采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行抗體親和性和特異性研究。通過(guò)方陣試驗(yàn)及篩選得到優(yōu)化濃度組合為：抗體28.30μg/ml、酶標(biāo)半抗原5.36μg/ml。氯霉素在0.2-64ng/ml濃度范

5、圍內(nèi)，抑制率與濃度呈線性關(guān)系，回歸方程為y=-14.843logx+56.692，R2=0.9965，IC50=2.82ng/ml，IC10=0.451ng/ml。與其他類(lèi)抗生素?zé)o明顯的交叉反應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)中確定了對(duì)雞肉，牛奶和新鮮蝦肉中氯霉素的提取方法，據(jù)此構(gòu)建的ELISA試劑盒可用于樣品中氯霉素的快速檢測(cè)。樣品的添加回收率范圍在72.6％-113.6％之間，變異系數(shù)在4.26％-17.75％之間。試劑盒性能測(cè)試結(jié)果表明，其