氯霉素ELISA檢測試劑盒的評價(jià)及初步改進(jìn).pdf

1、為了實(shí)現(xiàn)對氯霉素殘留的免疫分析，本實(shí)驗(yàn)室建立了檢測動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的ELISA快速檢測試劑盒。由于各國對氯霉素在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量(MRL)的規(guī)定越來越低，對氯霉素檢測試劑盒的靈敏度要求也隨之提高，由此，本實(shí)驗(yàn)對該試劑盒中的主要試劑和反應(yīng)條件進(jìn)行了進(jìn)一步改進(jìn)，研究結(jié)果如下。 1.氯霉素全抗原及酶標(biāo)記抗原的合成用化學(xué)方法合成了氯霉素半抗原的中間體，然后采用重氮化法將此中間體與人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BS

2、A)、卵清白蛋白(OVA)偶連制備了氯霉素全抗原；采用過碘酸鈉法合成了酶標(biāo)記抗原。氯霉素全抗原和酶標(biāo)記抗原經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定其合成是成功的。 2.氯霉素多克隆抗體的制備購進(jìn)20只日本大耳白兔，隨機(jī)分為7組，前6組免疫不同的氯霉素全抗原，第7組為空白對照，經(jīng)四次免疫后頸動(dòng)脈放血制備了抗血清。對抗血清進(jìn)行了飽和硫酸銨粗提、葡聚糖G<,200>純化，CAP-HSA組多克隆抗體效價(jià)和靈敏度最高，效價(jià)可達(dá)5×10<'5>，靈敏度用IC5

3、0表示可達(dá)4.5μg/L。 3.氯霉素單克隆抗體的制備用氯霉素全抗原免疫Balb/c小鼠，通過常規(guī)的細(xì)胞融合技術(shù)與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合；用間接ELISA和直接競爭ELISA進(jìn)行雙篩選，所得的陽性雜交瘤細(xì)胞株，采用有限稀釋法進(jìn)行了克隆，得到了4株單抗細(xì)胞株。在細(xì)胞株篩選的過程中發(fā)展了一種梯度篩選的方法，使篩選出的細(xì)胞株能夠分泌高親和力的抗體。 4.氯霉素ELISA檢測方法的考核ELISA方法的靈敏度：用IC<,50>表

4、示，變動(dòng)范圍在7.9μg/L～15.6μg/L之間，均值為11.6μg/L；方法的最低檢測限：對標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低檢測限為0.3rig/mL，對豬肌肉、雞肌肉中氯霉素的最低檢測限分別為2.540μg/kg、1.896μg/kg；方法的準(zhǔn)確度：當(dāng)添加濃度為3.0μg/kg～10.0μg/kg時(shí)，氯霉素在豬肉中的回收率均在60％～110％之間，批間變異系數(shù)均低于20％；方法的精密度：此方法批內(nèi)和批間變異系數(shù)均低于30ng/mL，符合殘留檢測要求

5、；ELISA檢測方法與GC方法的比較： ELISA法回收率為71.2％，低于GC法的87.6％，變異系數(shù)為6.7％，高于GC法的6.6％，但均屬正常波動(dòng)范圍。 5.氯霉素ELISA檢測試劑盒的研制試劑盒的穩(wěn)定性：2℃～8℃穩(wěn)定性試驗(yàn)及37℃加速穩(wěn)定性試驗(yàn)證明試劑盒在4℃可保存6個(gè)月；從ELISA方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等方面對自制試劑盒和荷蘭產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行了比較，結(jié)果自制試劑盒在靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等方面均低于荷蘭產(chǎn)的試劑