用于食品中李斯特細菌檢測的納米微懸臂梁傳感器技術(shù)的研究.pdf

1、1986年原子顯微鏡的發(fā)明在生物技術(shù)和納米技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)產(chǎn)生了新的傳感技術(shù):懸臂梁。由于這種技術(shù)對所檢測的樣品具有高度敏感性,目前對于懸臂梁傳感器的研究越來越受到了關(guān)注。這種類型的傳感技術(shù)在物理和生化方面的檢測應(yīng)用日益增多。本文深入的研究了面向基因檢測的兩種壓阻式懸臂梁傳感器,即硅微懸臂梁傳感器和二氧化硅微懸臂梁傳感器。在設(shè)計,制造以及測試這兩種微懸臂梁傳感器的基礎(chǔ)上,研究了微懸臂梁傳感器應(yīng)用于基因檢測的方法和特性。
　　本論文分為兩

2、個部分生物樣品的準備和傳感器的研究。
　　在生物樣品的準備方面我們設(shè)計了檢測李斯特細菌hlyA毒力基因探針,針對hlyA基因?qū)钏固丶毦M行細菌基因組DNA的提取,并作PCR反應(yīng)擴增所提取的基因,為了驗證擴增出的基因片段為hlyA毒力基因,我們構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-18T/hlyA進行克隆,并鑒定。利用所設(shè)計的基因探針與擴增出的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行斑點雜交來檢測樣品與探針之間的特異性。
　　從LM中擴增出hlyA基因,構(gòu)建出了原

3、核表達載體pGEX-3X/hlyA,并在大腸桿菌中表達了LLO蛋白,通過FactorXa切割所表達的融合蛋白的GST片段從而獲得了高純度的LL0,利用所表達的蛋白免疫動物獲得了多克隆抗體。并運用Westernblot對感染有LM的兔子與陽性表達的蛋白進行免疫學(xué)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與預(yù)期分子量相一致的蛋白條帶。
　　對兩種懸臂梁傳感器的理論模型和設(shè)計進行優(yōu)化。對于硅微懸臂梁傳感器,基于連續(xù)層合薄板模型,針對靈敏度和分辨率系統(tǒng)地分析和優(yōu)化

4、了設(shè)計參數(shù):對于二氧化硅微懸臂梁傳感器,提出了表面應(yīng)力負載時的非連續(xù)層合薄板模型,優(yōu)化了設(shè)計參數(shù)。并對二氧化硅微懸臂梁傳感器的自加熱效應(yīng)進行了研究。為有效地降低自加熱效應(yīng)所產(chǎn)生的噪聲,設(shè)計了差分模式來記錄二氧化硅微懸臂梁的電阻信號。
　　利用所研制的微懸臂梁傳感器,設(shè)計了基因檢測的方案,實現(xiàn)了對李斯特細菌毒力基因hlyA的檢測。研究了采用自組裝單分子膜在懸臂梁表面的修飾方案,并采用了XPS(X射線光電子能譜)進行驗證;在完成了表面

5、修飾后,實現(xiàn)了對李斯特細菌毒力基因hlyA基因的檢測。P型二氧化硅微懸臂梁傳感器對于基因的檢測的檢測限為:0.1μg/mL,硅微懸臂梁傳感器對于李斯特細菌的最低檢測限為:1.0μg/mL.與理論分析相一致。為了驗證傳感器對于所檢測基因的高度選擇性,利用與基因探針序列完全不互補雙鏈DNA進行反應(yīng),結(jié)果表明傳感器未對這種基因發(fā)生反應(yīng)。比較了2種傳感器對李斯特細菌的靈敏度,探索了傳感器噪聲產(chǎn)生的原因。為了檢測基因傳感器對于質(zhì)量的敏感程度,利用

6、2種不同分子量相同濃度的互補ssDNA發(fā)生的雜交反應(yīng)進行檢測,檢測結(jié)果表明納米微懸臂梁傳感器對于質(zhì)量的變化不敏感。為了驗證二氧化硅微懸臂梁傳感器對于所檢測樣品信號的穩(wěn)定性,對樣品進行了不同濃度的多次檢測,結(jié)果表明二氧化硅微懸臂梁傳感器基因檢測信號穩(wěn)定,誤差小。利用所設(shè)計的二氧化硅微懸臂梁傳感器檢測了原核表達產(chǎn)物L(fēng)LO與所研制的單克隆抗體之間的免疫反應(yīng),雖然產(chǎn)生了較大的噪聲,但是證實了傳感器的靈敏度較高。利用p型二氧化硅微懸臂梁傳感器檢測