R-乙基-3-羥基戊二酸酯間接生物合成路徑轉(zhuǎn)化新體系的建立.pdf

1、他汀類藥物作為非常有效的降血脂藥物，是全球的暢銷藥。尤其是第三代他汀類藥物瑞舒伐他汀在治療冠狀動脈疾病方面表現(xiàn)出非常好的療效。3，5-二羥基庚酸側(cè)鏈是瑞舒伐他汀的關(guān)鍵性側(cè)鏈，它是由手性化合物R-乙基-3-羥基戊二酸酯合成而來。因此，R-乙基-3-羥基戊二酸酯是當前研究的一個熱點。開發(fā)高效率、低成本、低污染的R-乙基-3-羥基戊二酸酯生產(chǎn)工藝，對于降低瑞舒伐他汀價格，提高產(chǎn)品質(zhì)量，增強我國制藥企業(yè)在該領(lǐng)域的國際競爭力，具有深遠的意義。本研

2、究旨在開發(fā)以R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯為底物的R-乙基-3-羥基戊二酸酯高效生物合成方法。
　　 ⑴檢測方法的開發(fā)。目前尚未有檢測方法可以同時實現(xiàn)R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯、R-乙基-4-氨甲?；?3-羥基丁酸酯和R-乙基-3-羥基戊二酸酯在線檢測的分析方法，而這三種物質(zhì)同時在線分析對于確定反應(yīng)路徑具有重要作用。通過對三種化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的分析，基于離子化合物在高效反相色譜洗脫中的特殊性質(zhì)，最后確立了實現(xiàn)三

3、種化合物同時分離的液相方法。對流動相組成和pH值進行優(yōu)化，最優(yōu)洗脫條件為：Hypersil ODS C18柱；檢測波長210 nm；流動相為甲醇/50 mM磷酸鈉鹽緩沖液(3:7，v/v，pH6.5)；柱溫40℃。通過驗證，結(jié)果顯示該方法具有良好的線性，重復(fù)性，專一性，較低的檢測限和定量限，較短的樣品分析時間。
　　 ⑵目標菌株的篩選。通過對采自江蘇梅山和海南五指山的兩份土樣進行選擇性篩選和顯色篩選，獲得了一批具有腈水解酶活性的

4、野生菌，但活性相對較弱，未能達到實際生產(chǎn)的要求。采用PCR高通量篩選方法，對混合菌落基因組DNA進行篩選，獲得兩條腈水解酶基因的保守序列。對實驗室已有的腈水解酶產(chǎn)生菌進行篩選，Rhodococcus boritolerans在轉(zhuǎn)化當前底物R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯產(chǎn)生R-乙基-3-羥基戊二酸酯上，表現(xiàn)出很好的活性。
　　 ⑶反應(yīng)路徑的確定及化合物鑒定。為了進一步了解該反應(yīng)進行的路徑，反應(yīng)過程進行全程取樣監(jiān)控。高效液相檢

5、測結(jié)果顯示該反應(yīng)存在中間體，可能是一個由兩步反應(yīng)組成的間接反應(yīng)。通過以R-乙基-4-氨甲?；?3-羥基丁酸酯為底物進行上述反應(yīng)，最終得到R-乙基-3-羥基戊二酸酯，由此進一步證實以上間接路徑。將上述中間體和產(chǎn)物分別進行質(zhì)譜、超導(dǎo)核磁共振(NMR)、旋光分析，結(jié)果顯示以上分析數(shù)據(jù)與R-乙基-4-氨甲?；?3-羥基丁酸酯和R-乙基-3-羥基戊二酸酯已報道的相關(guān)數(shù)據(jù)一致。因此，該反應(yīng)的路徑最終確定為以R-乙基-4-氨甲?；?3-羥基丁酸酯為中

6、間體的間接路徑，并由此推斷Rhodococcus boritolerans中可能同時存在腈水合酶和酰胺酶。
　　 ⑷反應(yīng)條件優(yōu)化。通過對酶催化反應(yīng)的溫度、pH、底物濃度進行優(yōu)化，得到該反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為：25℃，pH7.5，10 g/L R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯。在該反應(yīng)條件下，反應(yīng)的最終轉(zhuǎn)化率達到98.5％(w/w)，這是目前報道的從R-乙基-4-氰基-3-羥基-丁酸酯到R-乙基-3-羥基戊二酸酯的最高轉(zhuǎn)化率。加