抗乙酰肝素酶單抗的制備及其與紫杉醇聯(lián)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力的影響.pdf

1、目的：乙酰肝素酶（heparanase,HPA）作為唯一一種內(nèi)源性D-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，能夠降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)。而HSPG是糖胺聚糖的主要組成部分，在腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移過程中扮演著不可或缺的角色。HPA通過降解HSPG的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）側(cè)鏈而破壞了組織的完整性，并且促進(jìn)多種活性分子（生長因子、細(xì)胞因子等）的釋放，所以對(duì)腫瘤的浸潤、

2、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管的生成都有著重要的作用。本研究的目的在于篩選獲得特異性較好的抗HPA單克隆抗體，通過初步體外實(shí)驗(yàn)研究抗HPA單抗與紫杉醇聯(lián)用后對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力的影響。為研制抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物奠定基礎(chǔ)，為研究HPA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制以及在腫瘤診斷、治療、預(yù)后中的作用提供材料。選擇紫杉醇與抗HPA單抗聯(lián)用，為乳腺癌在臨床治療中奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)用已制備的原核表達(dá)HPA50kDa蛋白質(zhì)為抗原，免疫BALB/

3、c小鼠，用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)制備抗HPA單克隆抗體，經(jīng)捕獲型ELISA和試紙條測定小鼠抗體亞類，用PEG6000沉淀、分子篩層析對(duì)抗體進(jìn)行純化，通過間接ELISA和Western Blot進(jìn)行單克隆抗體特異性鑒定。通過MTT法、流式細(xì)胞術(shù)-PI單染、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)、Transwell法探討紫杉醇與抗 HPA單克隆抗體聯(lián)用后對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：（1）原核表達(dá)HPA50kDa蛋白質(zhì)在經(jīng)過透析、濃縮及蛋白濃度測

4、定后，作為抗原免疫5只BALB/c小鼠，三次免疫后通過間接ELISA檢測，3號(hào)和4號(hào)小鼠效價(jià)較高，達(dá)到了達(dá)到1:64000以上，選用4號(hào)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　采用細(xì)胞融合技術(shù)，取4號(hào)小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞用PEG融合，通過HAT篩選雜交瘤細(xì)胞，融合率約為90％，陽性率約為82%。亞克隆采用的是有限稀釋法，篩選出14株能夠穩(wěn)定分泌表達(dá)目的抗體的—抗HPA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2A4-2、2B9-2、2C3-2、2C8-

5、2、2F6-2、2G11-2、3B8-2、4B11-3、4D4-2、4E5-2、4G11-3、5C7-2、5F2-2、6D3-2。經(jīng)捕獲型ELISA和試紙條測定后，分泌抗體亞類均為IgM。選擇7株細(xì)胞（2B9-2、2C3-2、2C8-2、3B8-2、4B11-2、4D4-2、5C7-2）注射小鼠腹腔，制備腹水獲得單抗。
　　通過間接ELISA和Western Blot鑒定單克隆抗體特異性，得到特異性較好的3種抗體2C3-2、3B8

6、-2、4D4-2。在純化過程中，先采用PEG6000沉淀對(duì)腹水進(jìn)行初步純化，初步純化后抗體純度約為80%，再通過分子篩柱進(jìn)一步純化，濃縮后蛋白含量為0.116 mg/ml。
　　（2）選用純化后的抗 HPA單抗3B8-2，干預(yù)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞）后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變。單用抗HPA單抗時(shí)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7細(xì)胞、MCF-7/F5細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞、SK-BR-3細(xì)胞）抑制

7、作用最大的是MCF-7/F5細(xì)胞，在抗HPA單抗?jié)舛葹?μg/ml時(shí)的細(xì)胞抑制率為22.37%；紫杉醇單用時(shí)，對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴性；將紫杉醇與抗HPA單抗聯(lián)用后，對(duì)于4種乳腺癌細(xì)胞的抑制作用都有明顯的增強(qiáng)。對(duì)于細(xì)胞周期，兩藥聯(lián)用后MCF-7細(xì)胞、MCF-7/F5細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞分別出現(xiàn)了15%、33.7%、53.6%的細(xì)胞凋亡。在乳腺癌細(xì)胞MCF-7/F5的侵襲能力方面，抗HPA單抗干預(yù)組的穿透率為75%，

8、將紫杉醇與抗 HPA單抗聯(lián)用后，穿透率從紫杉醇干預(yù)時(shí)30%的穿透率降低至20%。與單用抗HPA單抗相比較，具有極顯著差異（P<0.01）；與單用紫杉醇相比較，具有顯著差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：（1）本實(shí)驗(yàn)篩選出能夠穩(wěn)定分泌高特異性的抗HPA單抗，并且制備出純度達(dá)90%以上的抗HPA單抗樣品。
　?。?）抗HPA單抗與紫杉醇聯(lián)用后，對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲的抑制作用與兩藥單用時(shí)的作用明顯增強(qiáng)，抗HPA單克隆抗體可增強(qiáng)紫杉醇