利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造適合纖維素乙醇生產(chǎn)的玉米新材料.pdf

1、由于化石能源的不可再生性和最終枯竭的不可避免性，能源危機(jī)已經(jīng)成為世界性的問題?？稍偕那鍧嵉纳镔|(zhì)能源已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，其中燃料乙醇的研究與生產(chǎn)最引人注目。目前，燃料乙醇主要是用玉米、甘蔗、薯類等農(nóng)作物發(fā)酵生產(chǎn)，成本過高，廣泛應(yīng)用受限。尋找新的生產(chǎn)原料和技術(shù)、降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本，已成為國內(nèi)外熱點(diǎn)研究課題。玉米作為一種飼料、糧食和能源作物，具有很高的綜合利用價(jià)值。其作為C4植物具有高光合速率和生長速率、能高效利用水資源、適應(yīng)區(qū)廣、

2、生育期較短等特點(diǎn)，是既產(chǎn)糧食又產(chǎn)生大量生物質(zhì)的生產(chǎn)者。利用玉米淀粉生產(chǎn)燃料乙醇因“與人爭糧”而面臨尷尬，而利用玉米生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇可充分利用玉米的生長特點(diǎn)，具有廣闊的前景。玉米生物質(zhì)的主要成分是木質(zhì)纖維素，而利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇由于生產(chǎn)成本一直居高不下而阻礙了其規(guī)模化生產(chǎn)。
　　 利用纖維素酶的催化反應(yīng)代替高溫高壓的化學(xué)反應(yīng)將纖維素水解為葡萄糖，再通過發(fā)酵可生產(chǎn)乙醇等有機(jī)化工，原料和燃料等在實(shí)踐中存在較大困難。主要原因之一是纖維

3、素酶的生產(chǎn)及木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程成本非常高。若能降低纖維素水解復(fù)合酶的應(yīng)用成本則使纖維素乙醇的生產(chǎn)成本大幅度降低。通過植物基因工程的方法來生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶以及通過改變木質(zhì)素含量或成份來減少預(yù)處理過程都是可解決這些問題的途徑。
　　 本論文工作的主線是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育能自身表達(dá)高活性纖維素酶的轉(zhuǎn)基因玉米植株和培育低木質(zhì)素的有利于纖維素酶降解莖葉的玉米材料，以獲得適宜纖維素乙醇生產(chǎn)的玉米新種質(zhì)，為降低生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的成本而

4、探索。
　　 (一)在玉米中過表達(dá)微生物基因編碼的纖維素酶
　　 依據(jù)已發(fā)表資料，從絲狀真菌瑞氏木霉中克隆了編碼外切葡聚糖酶基因的CBHI和編碼內(nèi)切葡聚糖酶基因的EGⅢ。為了控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)，克隆出絲狀真菌構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子alc系統(tǒng)。測序結(jié)果表明，后者堿基序列與已報(bào)道的序列有所差異，但是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA box和與轉(zhuǎn)錄因子alcR結(jié)合位點(diǎn)中的高度保守序列位置及序列

5、均完全相同。用獲得的啟動(dòng)子構(gòu)建帶有GUS融合基因的植物表達(dá)載體，利用基因槍法轟擊玉米胚芽鞘進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析，染色結(jié)果確定了該啟動(dòng)子具有乙醇誘導(dǎo)表達(dá)的功能。將纖維素酶基因和乙醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子構(gòu)建的融合基因插入到植物表達(dá)載體中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米芽尖轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入玉米，獲得了轉(zhuǎn)基因的玉米株系。對轉(zhuǎn)基因玉米植株的后代進(jìn)行PCR和Southern雜交分析，肯定了外源基因在玉米基因組中穩(wěn)定整合并遺傳給后代，轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)為1-2個(gè)。
　　 分別檢

6、測3葉期和10葉期的轉(zhuǎn)基因玉米，了解乙醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子在玉米中能否啟動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)，以及不同乙醇濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、持續(xù)誘導(dǎo)等因子對乙醇誘導(dǎo)基因表達(dá)強(qiáng)度的影響。在玉米植株中，alc系統(tǒng)可以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目刂颇康幕虻谋磉_(dá)。在非誘導(dǎo)狀態(tài)下，alc系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因玉米中處于關(guān)閉狀態(tài)，通過根部澆灌酒精后可啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。該系統(tǒng)非常靈敏，用0.1％(v/v)酒精誘導(dǎo)就能檢測到外源基因的表達(dá)。采用MUC的方法測定轉(zhuǎn)基因植株CBHI酶活性，得出酶活性變化與轉(zhuǎn)基因表達(dá)強(qiáng)

7、度的變化是一致韻。隨著澆灌的酒精濃度升高，轉(zhuǎn)基因植株CBHI酶活性增加，在2％(v/v)時(shí)達(dá)到最高峰，24h時(shí)酶活性達(dá)到2400 pmol MUmin-1mgTSP-1，之后酶活性不再升高。因此，選用2％的酒精濃度作為最佳濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。該濃度酒精對玉米植株無可見的毒害作用。不同酒精誘導(dǎo)時(shí)間的試驗(yàn)得出，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，mRNA及酶活性均有升高，最高點(diǎn)在96小時(shí)，酶活性達(dá)到4000 pmol MU min-1mg TSP-1。若在第

8、一次誘導(dǎo)72小時(shí)后再施用酒精進(jìn)行誘導(dǎo)，酶活性能進(jìn)一步提高，達(dá)到5000 pmol MU min-1mg TSP-1，這種水平可一直持續(xù)。2％的酒精誘導(dǎo)24小時(shí)之后，轉(zhuǎn)基因玉米的不同器官都檢測到酶活性，介于1278 pmol MU min-1 mg TSP-1到2026 pmol MU min-1 mg TSP-1，以葉中的酶活性最高。
　　 用2％(v/v)的酒精以根部澆灌的方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)EGⅢ基因植株，隨著酒精誘導(dǎo)時(shí)間的延長，EG

9、Ⅲ基因表達(dá)強(qiáng)度和酶活性逐步升高。無論是在酒精誘導(dǎo)前后，轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑纳L發(fā)育和形態(tài)特征未出現(xiàn)顯著差異。
　　 轉(zhuǎn)基因玉米植株產(chǎn)生的纖維素酶在不加任何保護(hù)劑的情況下分別在不同pH值和不同溫度下測定酶活性，并與最高的酶活性相比較，計(jì)算其相對活性(％)。外切葡聚糖酶CBHI在pH5.0、溫度45-50℃時(shí)較為穩(wěn)定，而內(nèi)切葡聚糖酶在pH4.5-5.0、溫度為50℃時(shí)較為穩(wěn)定。與大腸桿菌中表達(dá)的酶相比，具有更高的熱穩(wěn)定性及

10、更寬廣的 pH值適宜范圍。將轉(zhuǎn)基因植株葉片提取液分別在50℃和60℃下保溫，兩種纖維素酶的活性都隨著保溫時(shí)間延長而下降，變化趨勢較為一致。在50℃條件下放置2h，酶活性能夠保持在80％左右，而在60℃條件下放置1h時(shí)，酶活性就降低到40％以下。因此，轉(zhuǎn)基因玉米表達(dá)的纖維素酶可以耐受較長時(shí)間的50-60℃高溫，具有一定的熱穩(wěn)定性。將轉(zhuǎn)基因玉米葉片在不同溫度下保存，然后測定其酶活性。兩種酶活性變化趨勢類似，在常溫(28℃)條件下保存時(shí)，1天

11、后酶活性降低到最初的85％左右，3天時(shí)降低到63％左右，5天的時(shí)為41％左右。若將葉片保存在-20℃，5天后酶活性為最初活性的85％。因此，轉(zhuǎn)基因玉米植株可以在低溫儲(chǔ)存條件下保持較長時(shí)間纖維素酶活性。
　　 將兩種纖維素酶液混合，用于降解纖維素，用DNS法測定還原糖的生成量。結(jié)果表明，兩種纖維素酶在降解纖維素方面具有協(xié)同作用，兩種酶一同降解纖維素的效果要比單酶降解效果好，能夠產(chǎn)生更多的還原性糖。并且隨著加入的酶蛋白增多，還原性多

12、糖的生成量增加。
　　 (二)玉米木質(zhì)素合成酶基因的抑制表達(dá)對木質(zhì)素含量的影響
　　 木質(zhì)素合成是由多個(gè)酶促反應(yīng)組成的復(fù)雜過程，肉桂醇脫氫酶(CAD)和肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)基因編碼木質(zhì)素合成途徑中催化最后兩步的關(guān)鍵酶。以玉米為材料，從cDNA中克隆出CAD和CCR基因，分別構(gòu)建它們的RNAi結(jié)構(gòu)。利用載體pFGC5941構(gòu)建出由組成型啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)RNAi結(jié)構(gòu)和以除草劑抗性基因bar為篩選標(biāo)記的植物表達(dá)

13、載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米芽尖轉(zhuǎn)化方法獲得玉米轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)過PCR檢測和Southern雜交鑒定，確定了RNAi結(jié)構(gòu)已整合到玉米的基因組中且穩(wěn)定遺傳。采用RT-PCR方法檢測靶基因的表達(dá)，得出未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旰娃D(zhuǎn)基因植株均出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增產(chǎn)物亮度明顯弱于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?。采用Real-time RT-PCR檢測靶基因的表達(dá)強(qiáng)度，得出不同轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)豐度有一定差異。在抑制CAD表達(dá)的轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)株系中，CAD基因表達(dá)豐度

14、為對照植株的40％～89％。在抑制CCR表達(dá)的轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)株系中，CCR基因表達(dá)豐度為對照植株的36％～94％。即RNAi結(jié)構(gòu)的導(dǎo)入，轉(zhuǎn)基因植株的內(nèi)源CAD和CCR基因的轉(zhuǎn)錄本減少。轉(zhuǎn)基因植株的酶活性測定表明，在抑制CAD基因的株系中酶活性是對照植株的65％-93％，在抑制CCR基因的株系中酶活性是對照的59％-90％。在這些轉(zhuǎn)基因株系中CAD和CCR基因的表達(dá)變化與酶活性的變化趨勢一致，表明是RNAi結(jié)構(gòu)的表達(dá)導(dǎo)致這兩個(gè)基因的表達(dá)下

15、降而引起植株CAD或CCR酶活性降低。
　　 對轉(zhuǎn)基因植株性狀觀測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CAD基因株系與野生型對照相比，株高和葉片大小大致相同，抗倒性和抗病性變化不明顯，開花和結(jié)籽正常。在轉(zhuǎn)CCR基因的株系中，有些株系的植株與野生型大致相同，也有部分株系的植株與野生型相比株高偏低，但開花結(jié)籽正常，抗倒性和抗病性無明顯變化。說明轉(zhuǎn)基因植物中木質(zhì)素足以維持植物正常的生理活動(dòng)。對生長3個(gè)月的灌漿期轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Klason木質(zhì)素分析，與對照植株相比

16、，轉(zhuǎn)基因株系的Klason木質(zhì)素都有不同程度的下降，占細(xì)胞壁干重19-20％。RNAi抑制CCR基因表達(dá)對木質(zhì)素含量的影響要強(qiáng)于CAD的抑制作用。在轉(zhuǎn)CAD基因株系中，木質(zhì)素減少的變化范圍為7.5-14.7％；在轉(zhuǎn)CCR基因株系中，木質(zhì)素減少的變化范圍為11.7-18.9％?？梢姂?yīng)用RNAi技術(shù)能有效抑制靶基因表達(dá)，進(jìn)而降低轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素含量，但降低幅度仍待提高。在轉(zhuǎn)基因植株中，盡管木質(zhì)素含量下降，但綜纖維素含量與對照相比并沒有明顯

17、差別，說明木質(zhì)素合成被抑制沒有影響綜纖維素的合成和積累。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中，無論是干擾CAD還是干擾CCR的表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植株中都能檢測到 PAL轉(zhuǎn)錄本豐度明顯提高，與之對應(yīng)的是可溶性總酚含量明顯提高。植物體內(nèi)大多數(shù)酚類物質(zhì)的合成經(jīng)歷苯丙烷類合成途徑，PAL是該條途徑的關(guān)鍵酶，PAL表達(dá)強(qiáng)度的提高和可溶性酚類物質(zhì)的增加表明細(xì)胞碳代謝可能發(fā)生重大調(diào)整。有可能木質(zhì)素合成的下游步驟被限速，刺激了植株產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)，促進(jìn)中間物向酚類物質(zhì)

18、合成途徑分配，以保證有足量得可溶性糖類物質(zhì)流入細(xì)胞次生代謝。由于酚類物質(zhì)是植保素的最重要成員，其含量增多意味著植物抗病能力的提高。阿魏酸在細(xì)胞壁的積累可能是由于CAD及CCR活性降低的結(jié)果，很可能是木質(zhì)素含量下降而植株抗病性和抗倒性無明顯變化的原因。從轉(zhuǎn)基因玉米植株表型來看，木質(zhì)素適當(dāng)降低可以維持玉米植株的正常生理活動(dòng)和生長發(fā)育。
　　 綜上所述，alc系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因玉米中能夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目刂仆庠椿虻谋磉_(dá)，這是在單子葉植物中運(yùn)用化學(xué)可