利用轉(zhuǎn)基因策略創(chuàng)造高淀粉、高直鏈淀粉玉米新種質(zhì).pdf

1、玉米是最重要的糧食和飼料作物之一，也是食品和化工的重要原料，在人類生活中起著舉足重輕的作用。全世界淀粉年產(chǎn)量為3600萬(wàn)噸，其中80％以上是玉米淀粉，加強(qiáng)高淀粉玉米育種具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。直鏈淀粉是重要的工業(yè)原料，用途廣泛，涉及到各個(gè)領(lǐng)域，如食品、塑料、醫(yī)療等行業(yè)。但是普通玉米的直鏈淀粉含量約22％-28％，從普通玉米提取直鏈淀粉成本很高。目前，我國(guó)所需的直鏈淀粉主要依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴。采用常規(guī)育種技術(shù)選育高直鏈淀粉玉米遇到的

2、主要問(wèn)題是玉米淀粉總含量減少，籽粒含水分量增高，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行高直鏈淀粉玉米品種培育是一種值得探索的途徑。過(guò)表達(dá)AGPase提高玉米淀粉含量和籽粒產(chǎn)量
　　 淀粉合成的主要場(chǎng)所是淀粉體和葉綠體，整個(gè)過(guò)程受到一系列酶活性的調(diào)控。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是淀粉合成途徑的限速酶，主要功能是把1-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為合成淀粉的底物ADPG。過(guò)表達(dá)AGPase基因有可能提高AGPase的活性，促進(jìn)淀粉合成。玉米AGPase是由兩個(gè)大亞基

3、和兩個(gè)小亞基組成的異四聚體，大、小亞基分別由Sh2和Bt基因編碼。該酶在玉米籽粒發(fā)育和淀粉合成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　 本工作通過(guò)RT-PCR的方法從玉米胚乳cDNA中克隆出玉米AGPase的大、小亞基基因Sh2和Bt2，選用玉米胚乳特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)Sh2和Bt2基因表達(dá)，以除草劑抗性基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，構(gòu)建出Sh2、Bt2單基因過(guò)表達(dá)植物載體和二者串聯(lián)的過(guò)表達(dá)植物載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米芽尖遺傳轉(zhuǎn)化方法，將三種載體上目標(biāo)基

4、因分別轉(zhuǎn)入玉米骨干自交系昌7-2和掖478。PCR和Southern檢測(cè)證明，外源基因整合到轉(zhuǎn)基因玉米植株的基因組內(nèi)，并在后代中穩(wěn)定表達(dá)，選擇來(lái)源于不同獨(dú)立轉(zhuǎn)化體的且外源基因單拷貝插入的株系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)、淀粉合成、籽粒產(chǎn)量及其它農(nóng)藝性狀的研究。
　　 對(duì)不同灌漿期(10DAP，15DAP，20DAP，30DAP)的轉(zhuǎn)基因純合植株及其野生型對(duì)照的籽粒進(jìn)行基因表達(dá)分析和酶活性測(cè)定，對(duì)成熟后的種子進(jìn)行淀粉含量分析和百粒重測(cè)定，發(fā)現(xiàn)A

5、GPase基因的表達(dá)和酶活性在籽粒發(fā)育前期都隨著發(fā)育進(jìn)程而增加，在20DAP時(shí)達(dá)到高峰，隨后緩慢下降。在檢查的轉(zhuǎn)基因植株中AGPase基因的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株的，酶活性也發(fā)生相應(yīng)的變化，轉(zhuǎn)Sh2或Bt2基因的植株變化幅度小于轉(zhuǎn)Sh2和Bt2雙基因的植株的，轉(zhuǎn)Sh2基因和Bt2基因的植株之間的差異不明顯。成熟種子的淀粉含量分析表明，淀粉含量的變化與基因表達(dá)和酶活性變化呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)。在轉(zhuǎn)Sh2或Bt2基因的株系中，淀粉含量分別由

6、野生型的66％(昌7-2)或65％(掖478)升高到71～74％不等；而轉(zhuǎn)Sh2和Bt2雙基因的株系中，淀粉含量增加到76～78％，較野生型對(duì)照提高約16.7％。轉(zhuǎn)基因植株的百粒重也有明顯提高，與對(duì)照昌7-2相比，轉(zhuǎn)基因株系的百粒重分別提高20％(Bt2)、18％(Sh2)和30％(Bt2Sh2)；與對(duì)照掖478相比，轉(zhuǎn)基因株系的百粒重分別提高22％(Bt2)、20％(Sh2)和33％(Bt2Sh2)。通過(guò)不同株系植株的盆栽和大田比較試

7、驗(yàn)得出，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)正常，果穗長(zhǎng)、穗行數(shù)、籽粒數(shù)等與對(duì)照植株的差異不顯著，而穗重、百粒重、淀粉含量則變化顯著，較非轉(zhuǎn)基因植株有明顯提高。果實(shí)籽粒大小也有明顯變化，轉(zhuǎn)Sh2租Bt2雙基因的植株增加最顯著。
　　 在本工作采用來(lái)自玉米醇溶蛋白基因的胚乳特異型啟動(dòng)子，大大增強(qiáng)了AGPase基因在玉米胚乳中的表達(dá)。過(guò)表達(dá)Bt2基因或Sh2基因都能提高AGPase活性，而B(niǎo)t2和Sh2基因的共同過(guò)表達(dá)將AGPase活性提高到一個(gè)顯著水平

8、。這意味著玉米胚乳AGPase活性的增強(qiáng)可能是通過(guò)增強(qiáng)四聚體數(shù)量及其穩(wěn)定性來(lái)實(shí)現(xiàn)，胚乳Sh2或Bt2蛋白的大量增多使AGPas四聚體更趨于穩(wěn)定或有更多的四聚體形成。灌漿期胚乳AGPase活性的增加，不僅可加速碳水化合物的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)胚乳淀粉合成，提高種子的增重速率，間接促進(jìn)光合作用，最終提高玉米產(chǎn)量。因此，可通過(guò)提高玉米胚乳內(nèi)AGPase活性培育出光合效率高、籽粒產(chǎn)量高和淀粉含量高的玉米新品種。本工作是一個(gè)成功的實(shí)例，為培育玉米優(yōu)良

9、自交系提供一個(gè)切實(shí)可行的途徑。
　　 利用RNAi機(jī)制創(chuàng)制高直鏈淀粉玉米新材料
　　 直鏈淀粉的合成受多基因控制，復(fù)雜的基因環(huán)境互作也參與影響胚乳直鏈淀粉的含量。增加胚乳直鏈淀粉的含量往往伴隨著產(chǎn)量和其它農(nóng)藝性狀的降低。淀粉分支酶是淀粉生物合成過(guò)程中一個(gè)起重要調(diào)節(jié)作用的酶，它能切開(kāi)葡萄糖間的α(1，4)糖苷鍵，并把切下的短鏈通過(guò)α(1，6)糖苷鍵連接于受體鏈上，形成分枝結(jié)構(gòu)，抑制淀粉分支酶基因的表達(dá)可降低酶活性，從而減少

10、支鏈淀粉合成，提高直鏈淀粉的含量。玉米淀粉分支酶SBE可分為三種同工酶SBEI、SBEIIa和SBEIIb，其中SBEIIb對(duì)胚乳直鏈淀粉含量的作用最大。
　　 本論文通過(guò)RT-PCR的方法從玉米胚乳cDNA中克隆出玉米淀粉分支酶基因SBEIIα、IIb的特異區(qū)和保守區(qū)片段，分別構(gòu)建出SBE的RNAi結(jié)構(gòu)，后者由胚乳特異的啟動(dòng)子P27Kd或組成性啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)。為了獲得最優(yōu)的干擾效果，使直鏈淀粉大幅度的提高以滿足塑料工業(yè)的需要

11、，分別以SBEIIα和SBEIIb保守序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建出hpRNA臂長(zhǎng)分別為893bp和467bp的RNAi結(jié)構(gòu)；以SBEIIα中長(zhǎng)度為417bp和154bp的特異序列分別與SBEIIb的一段295bp的特異序列相連接，構(gòu)建不同的hpRNA結(jié)構(gòu)；選用不同RNAi結(jié)構(gòu)內(nèi)含子和不同的啟動(dòng)子，構(gòu)建具有特定的RNAi結(jié)構(gòu)。通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，將這些RNAi結(jié)構(gòu)重組到植物表達(dá)載體中，獲得了10個(gè)具有不同特點(diǎn)的植物表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將

12、不同RNAi結(jié)構(gòu)導(dǎo)入玉米骨干自交系昌7-2，從轉(zhuǎn)化植株后代中篩選出7個(gè)轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)生產(chǎn)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系。除草劑抗性篩選、PCR檢測(cè)和Southern blotting驗(yàn)證及轉(zhuǎn)基因表達(dá)強(qiáng)度分析肯定我們獲得了轉(zhuǎn)基因純合株系，RNAi結(jié)構(gòu)穩(wěn)定插入到玉米基因組中。
　　 選擇來(lái)源于不同獨(dú)立轉(zhuǎn)化體且外源基因單拷貝插入的轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)的株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀觀察和基因表達(dá)強(qiáng)度、SBE酶活性、籽粒淀粉含量、直鏈淀粉含量測(cè)定，得出轉(zhuǎn)入的RNAi結(jié)構(gòu)有效抑

13、制了SBEII基因的表達(dá)，大幅度降低了胚乳SBE的酶活性，與野生型對(duì)照相比顯著提高了直鏈淀粉含量，植株形態(tài)特征和生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯變化，但總淀粉含量及籽粒產(chǎn)量有一定降低。
　　 在灌漿期20DAP時(shí)測(cè)定SBEII的基因表達(dá)強(qiáng)度和SBE酶活性，得出轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)的植株SBEII的基因表達(dá)強(qiáng)度和SBE酶活性都有不同程度的降低，轉(zhuǎn)35S啟動(dòng)RNAi結(jié)構(gòu)的株系抑制效率低于27Kd啟動(dòng)的；用SBEIIb不同長(zhǎng)度的保守序列構(gòu)建的RNAi結(jié)構(gòu)，干

14、擾效果差別不大；由SBEIIα和SBEIIb特異區(qū)構(gòu)建的RNAi結(jié)構(gòu)抑制效果最好。含較短內(nèi)含子的RNAi結(jié)構(gòu)抑制效率相對(duì)較高。
　　 測(cè)定轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)植株和對(duì)照植株的成熟種子的胚乳直鏈淀粉和總淀粉含量，對(duì)帶有不同RNAi結(jié)構(gòu)的株系進(jìn)行比較，得出以SBEIIb保守區(qū)為基礎(chǔ)構(gòu)建的不同臂長(zhǎng)的RNAi結(jié)構(gòu)對(duì)直鏈淀粉含量的影響彼此無(wú)明顯差異，而以SBEIIα特異序列各SBEIIb特異序列相連構(gòu)成的RNAi結(jié)構(gòu)似乎臂長(zhǎng)712bp的優(yōu)于34

15、9bp的；由SBEIIα特異序列和SBEIIb特異序列相連構(gòu)成的RNAi結(jié)構(gòu)提高直鏈淀粉的幅度大于僅由SBEIIb保守序列組成的；P27Kd啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的RNAi結(jié)構(gòu)對(duì)直鏈淀粉提高的程度高于35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，并且轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)和生長(zhǎng)發(fā)育更類似于野生型對(duì)照的；用catalase intron替換pFGC5941載體中的內(nèi)含子可使合成更多的直鏈淀粉。伴隨著胚乳直鏈淀粉含量的增加，籽粒淀粉總含量和百粒重降低。同時(shí)干擾SBEIIα和SBEIIb

16、的株系直鏈淀粉含量達(dá)到55％(盆栽)或54％(大田)，總淀粉含量不到60％，總淀粉含量較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?5％降低了10％，而百粒重只有17g，約為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?20.2g/100粒)84％。抑制SBE的活性，對(duì)淀粉合成可能有限制作用，從而導(dǎo)致淀粉含量減少、百粒重的降低。
　　 在田間比較試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的株高、穗位高、果穗長(zhǎng)、穗重等多個(gè)性狀的分析，得出轉(zhuǎn)基因植株性狀與非轉(zhuǎn)基因植株相比較變化不明顯，只是在轉(zhuǎn)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)

17、的RNAi結(jié)構(gòu)植株中株高和葉片面積低于野生型的。
　　 本工作獲得了玉米高直鏈淀粉新種質(zhì)，并為玉米R(shí)NAi結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高直鏈淀粉玉米的工作積累了重要資料。
　　 通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株的雜交培育高淀粉高直鏈淀粉玉米材料
　　 采用RNAi的方法，我們得到了直鏈淀粉高達(dá)55％的玉米株系，而總淀粉含量卻低于野生型對(duì)照的，為了解決總淀粉含量降低，產(chǎn)量下降的問(wèn)題，有必要將能夠提高淀粉合成限速步驟的過(guò)表達(dá)載體引入

18、高直鏈淀粉玉米體中，使其胚乳內(nèi)AGPase的活性能夠得到提高，從而推動(dòng)有更多的碳水化合物用于胚乳淀粉合成，增加淀粉含量和玉米產(chǎn)量。本工作中，用于雜交的親本材料選取淀粉含量最高的轉(zhuǎn)AGPase大小亞基基因的轉(zhuǎn)基因植株和RNAi效果較好高直鏈淀粉植株，轉(zhuǎn)基因材料的受體基因型均為昌7-2。
　　 以3個(gè)轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)基因的植株為父本，以3個(gè)轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)的植株為母本，這些植株分別來(lái)自不同的轉(zhuǎn)基因純合株系，進(jìn)行成對(duì)雜交，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因聚合的F1代

19、。Southern雜交結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)AGPase基因結(jié)構(gòu)和RNAi結(jié)構(gòu)均存在于轉(zhuǎn)基因聚合植株的基因組中。
　　 將帶有過(guò)表達(dá)AGP酶基因和RNAi結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因聚合植株F1代、未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏逆⒚媒环N子、高淀粉玉米姊妹交種子和高直鏈淀粉姊妹交種子播種于相同的花盆中，在適應(yīng)條件下生長(zhǎng)，套袋自交，測(cè)定籽粒20DAP時(shí)的目標(biāo)基因表達(dá)水平和酶活性，籽粒成熟干燥后成對(duì)胚乳淀粉含量和直鏈淀粉含量，同時(shí)觀察記載植株形態(tài)特征和株高、百粒重等農(nóng)藝性

20、狀的變化。
　　 在轉(zhuǎn)基因聚合株系胚乳中，Bt2、Sh2的表達(dá)豐度較父本玉米植株的稍低，仍顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?，AGPase活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)；而SBEII的表達(dá)水平較母本略有升高，但達(dá)不到差異顯著水平，仍大幅度低于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?，SBE活性變化表現(xiàn)出同樣趨勢(shì)。即在轉(zhuǎn)基因聚合株系中，過(guò)表達(dá)AGPase和抑制SBE都得到實(shí)現(xiàn)。測(cè)定胚乳淀粉含量和直鏈淀粉含量，得出轉(zhuǎn)基因聚合植株的直鏈淀粉含量雖較母本有所下降，但依然高于50％

21、，遠(yuǎn)大于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?8％。轉(zhuǎn)基因聚合植株的淀粉含量約71％，比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?66％)提高了6％，但與高淀粉父本植株(78％)相比仍有較大差距。轉(zhuǎn)基因聚合植株生長(zhǎng)發(fā)育生長(zhǎng)，株高、穗位高、穗長(zhǎng)和籽粒表型較非轉(zhuǎn)基因植株變化不顯著，但轉(zhuǎn)基因聚合植株的百粒重比轉(zhuǎn)RNAi結(jié)構(gòu)的高直鏈淀粉植株提高了18％以上，比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹?-2相近或略高。即轉(zhuǎn)基因聚合植株中既擁有較高的直鏈淀粉含量、又有提高了淀粉含量，為獲得高淀粉高直鏈淀粉含量的玉米提高了成

22、功的實(shí)例。
　　 綜上所述，本論文工作首次獲得了利用過(guò)表達(dá)AGPase大小亞基雙基因的方法使玉米淀粉含量和籽粒體積顯著提高的高淀粉玉米新種質(zhì)；以RNAi技術(shù)獲得了淀粉含量達(dá)55％的高直鏈淀粉玉米，并比較了不同RNAi結(jié)構(gòu)對(duì)靶基因表達(dá)的抑制效果；通過(guò)不同轉(zhuǎn)基因植株雜交的方式實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AGPase基因和抑制SBEII基因表達(dá)在玉米胚乳中同時(shí)實(shí)現(xiàn)，獲得了高淀粉高直鏈淀粉玉米新材料。這些工作為培育具有巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的高淀粉玉米、高直鏈淀粉