基于表面原子轉(zhuǎn)移自由基聚合和納米探針的生物分析新方法.pdf

1、復(fù)雜生物樣品中與疾病相關(guān)生物分子的靈敏、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于研究疾病的發(fā)生發(fā)展、疾病診斷與治療等具有十分重要的意義。但由于在疾病的發(fā)生發(fā)展初期，相關(guān)生物分子在組織或血液中表達(dá)很低，利用常規(guī)方法無法檢測(cè)到，難以實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷，因此發(fā)展生物分析新原理新方法，實(shí)現(xiàn)生物檢測(cè)的信號(hào)放大并有效提高檢測(cè)靈敏度，是目前生物分析化學(xué)領(lǐng)域的熱門課題。本論文圍繞生物分子檢測(cè)的信號(hào)放大方法需求，基于表面原子轉(zhuǎn)移自由基聚合和納米探針，開展了以下三個(gè)方面的工作:

2、
　　 1、表面原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)基礎(chǔ)及其生物傳感應(yīng)用
　　 將引發(fā)劑分子通過共價(jià)鍵合的方式與DNA或蛋白質(zhì)分子偶連，研究固體表面生物分子存在時(shí)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)原理及基礎(chǔ)條件。進(jìn)一步利用DNA雜交或夾心免疫反應(yīng)將標(biāo)記有引發(fā)基團(tuán)的生物分子固定到電極或基質(zhì)表面，選擇具有側(cè)鏈功能基團(tuán)的單體進(jìn)行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)。該聚合反應(yīng)由引發(fā)基團(tuán)數(shù)量（固定的標(biāo)記生物分子數(shù)量）及其外部條件（催化劑、單體量、溫度、溶劑等）控制，當(dāng)

3、引發(fā)基團(tuán)數(shù)量（生物分子濃度）確定時(shí)，聚合物的生長(zhǎng)使成百上千個(gè)單體分子聚集形成長(zhǎng)鏈聚合物，由于聚合物的側(cè)鏈帶有功能基團(tuán)且能與電化學(xué)或光學(xué)活性物質(zhì)發(fā)生鍵合反應(yīng)，從而顯著增加了單元生物分子識(shí)別反應(yīng)的信號(hào)分子負(fù)載量，實(shí)現(xiàn)了生物分子檢測(cè)的信號(hào)放大，提高了檢測(cè)靈敏度。
　　 基于這種表面原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)輔助的信號(hào)放大方法，成功地構(gòu)建了四種生物傳感器:
　　 (1) DNA/卵清蛋白(ovalbumin)電化學(xué)傳感器。利用DNA

4、雜交或分子特異性識(shí)別將標(biāo)記有引發(fā)基團(tuán)的DNA檢測(cè)探針或ovalbumin固定到電極或金片表面，選擇具有活性羥基的甲基丙烯酸2-羥乙酯(HEMA)或具有環(huán)氧基的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)單體進(jìn)行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)。橢圓偏振計(jì)數(shù)據(jù)表明，金片上形成的聚合物的厚度大約為20 nm。形成的長(zhǎng)鏈聚合物的側(cè)鏈帶有羥基或環(huán)氧基能與電化學(xué)活性物質(zhì)氨基二茂鐵(FcNH2)發(fā)生鍵合反應(yīng)，鍵合在聚合物鏈上的二茂鐵衍生物具有靈敏的電化學(xué)響應(yīng)，可用于溶液中

5、DNA/ovalbumin的測(cè)定。最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，DNA濃度的對(duì)數(shù)在濃度為0.1～1000 nM范圍內(nèi)與電化學(xué)信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限為15 pM; ovalbumin濃度的對(duì)數(shù)在濃度為在0.1～500ng mL-1范圍內(nèi)與電化學(xué)信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限為0.07 ng mL-1。
　　 (2)前列腺抗原(PSA)/癌胚抗原(CEA)電化學(xué)傳感器。利用夾心免疫反應(yīng)將標(biāo)記有引發(fā)基團(tuán)的PSA或CEA固定到電極或金片表面，

6、以GMA為單體進(jìn)行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)。通過形成的長(zhǎng)鏈聚合物側(cè)鏈上環(huán)氧基嫁接FcNH2，制得靈敏的PSA/CEA電化學(xué)傳感器。最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，PSA和CEA濃度的對(duì)數(shù)分別在濃度為0.001～40 ng mL-1及0.0005～40 ng mL-1范圍內(nèi)與電化學(xué)信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限分別為0.14 pg mL-1和0.10 pg mL-1。制得的傳感器分別對(duì)60個(gè)PSA和40個(gè)CEA臨床血樣進(jìn)行了檢測(cè)，所得結(jié)果與臨床電致化學(xué)發(fā)光

7、方法得到的結(jié)果一致。
　　 (3) PSA電化學(xué)和流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。利用夾心免疫反應(yīng)將標(biāo)記有引發(fā)基團(tuán)的PSA固定到電極或金片表面，以GMA為單體進(jìn)行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)。利用長(zhǎng)鏈聚合物側(cè)鏈上豐富的環(huán)氧基團(tuán)與具有電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光活性的辣根過氧化物酶(HRP)分子中的活性氨基之間的化學(xué)反應(yīng)，將HRP偶聯(lián)在聚合物表面，制得PSA免疫傳感器。最優(yōu)條件下，PSA在濃度為0.0005～20 ng mL-1范圍內(nèi)分別與電化學(xué)信號(hào)及

8、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限分別為1.3 pg mL-1和4.0 pg mL-1。電化學(xué)信號(hào)和流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光信號(hào)較傳統(tǒng)的用HRP標(biāo)記的抗體作為信號(hào)分子的檢測(cè)信號(hào)分別放大了14和13倍。
　　 (4) CEA電致化學(xué)發(fā)光(ECL)傳感器。利用夾心免疫反應(yīng)將標(biāo)記有引發(fā)基團(tuán)的CEA固定在電極或金片表面，選擇具有環(huán)氧基的GMA單體進(jìn)行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，并將具有ECL活性的N,N-二異丙基乙二胺(DPEA)偶聯(lián)在

9、形成的聚合物的側(cè)鏈上，制得CEA電致化學(xué)發(fā)光傳感器。最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，CEA在濃度為0.001～1000 ng mL-1范圍內(nèi)與ECL信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限為0.5 pg mL-1。
　　 基于表面原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)輔助的信號(hào)放大方法構(gòu)建的生物傳感器具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，可用于檢測(cè)低濃度的DNA和蛋白質(zhì)，為腫瘤疾病的早期診斷與治療提供了新途徑。
　　 2、基于納米生物探針的信號(hào)放大方法及其在

10、生物傳感中的應(yīng)用
　　 將信號(hào)分子負(fù)載在二氧化硅(SiO2)納米粒子表面或包裹在SiO2納米粒子內(nèi)部，并進(jìn)一步在其外表面嫁接對(duì)生物分子具有選擇性的識(shí)別元素，制得納米探針。由于SiO2納米粒子可負(fù)載更多的信號(hào)分子，從而顯著增加單元生物分子識(shí)別反應(yīng)的信號(hào)分子負(fù)載量，提高了檢測(cè)靈敏度?；诖怂悸罚频昧藘煞N生物傳感器:
　　 (1)甲胎蛋白(AFP)免疫傳感器。首先用種子生長(zhǎng)法制得顆粒分散均勻，直徑為100±3 nm的SiO2

11、納米粒子。然后將SiO2納米粒子表面用γ-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPMS)進(jìn)行硅烷化處理，并一步將HRP和AFP二抗以一定比例共同固定在其表面，制得AFP納米生物探針。最后利用夾心免疫反應(yīng)將AFP納米生物探針捕獲到電極或金片表面，構(gòu)建了靈敏的AFP免疫傳感器。最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，AFP在濃度為0.05～3 ng mL-1范圍內(nèi)與電化學(xué)信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限為0.01 ng mL-1; AFP在濃度為0.01～3 ng mL

12、-1范圍內(nèi)與流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限為0.01 ng mL-1。電化學(xué)信號(hào)和流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光信號(hào)較傳統(tǒng)的用HRP標(biāo)記的抗體作為信號(hào)分子的檢測(cè)信號(hào)分別放大了29.5和61倍。
　　 (2)凋亡肝癌細(xì)胞（HepG2）ECL傳感器。首先用反相微乳法合成了包裹有Ru(bpy)32+的尺寸規(guī)整、直徑大約為50 nm的SiO2納米小球。然后將磷酯酰絲氨酸抗體(APSA)固定在經(jīng)硅烷化處理后的SiO2納米粒子表面，制得納

13、米探針。利用納米探針表面的APSA與修飾在電極上的凋亡HepG2細(xì)胞表面上的磷酯酰絲氨酸抗原(PS)之間的免疫反應(yīng)將上述納米生物探針固定在電極表面，制得靈敏的凋亡HepG2細(xì)胞ECL傳感器。最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)在800～1.0×107 cells mL-1與ECL信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，并借助于熒光光譜和熒光顯微鏡，評(píng)估了抗腫瘤藥物與細(xì)胞的相互作用，監(jiān)控了腫瘤細(xì)胞表面抗原的動(dòng)態(tài)變化，并檢測(cè)了細(xì)胞的異質(zhì)性。
　　 基于納米探

14、針的信號(hào)放大方法制備的生物傳感器操作簡(jiǎn)單、價(jià)廉、特異性強(qiáng)，為臨床腫瘤標(biāo)志物的靈敏檢測(cè)、藥物篩選和個(gè)體用藥提供了新方法。
　　 3、硼酸修飾納米填充柱的制備及其生物傳感應(yīng)用
　　 在瓊脂糖凝膠或玻璃微球表面嫁接硼酸基團(tuán)，并填充在毛細(xì)管中作為硼酸免疫分析柱，利用硼酸基團(tuán)對(duì)糖類抗原的點(diǎn)位識(shí)別作用，建立了血液中糖類抗原的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光(CL)免疫檢測(cè)方法。
　　 (1)玻璃微球?yàn)檩d體的硼酸免疫分析柱。首先將玻璃微球硅烷

15、化，使其表面形成環(huán)氧硅烷單層，并進(jìn)一步與氨基苯硼酸(APBA)上的氨基之間發(fā)生開環(huán)化學(xué)反應(yīng)，將APBA修飾到玻璃球表面并填充在玻璃管中，利用硼酸基團(tuán)對(duì)糖類抗原AFP的識(shí)別作用，將AFP抗原固定在分析柱中，制得硼酸免疫分析柱。然后通過免疫反應(yīng)，將分析物AFP和辣根過氧化物酶標(biāo)記的AFP抗體(HRP-anti-AFP)的混合物中游離的HRP-anti-AFP捕獲到分析柱中。最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，AFP濃度在10～100 ng mL-1范圍內(nèi)與CL

16、信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)是0.993。
　　 (2)瓊脂糖凝膠為載體的硼酸免疫分析柱。將硼酸瓊脂糖凝膠填充在玻璃管中，利用硼酸基團(tuán)對(duì)糖類抗原AFP的識(shí)別作用，將AFP固定到分析柱中，制備成硼酸免疫分析柱。然后通過免疫反應(yīng)，將溫育溶液中游離的HRP-anti-AFP捕獲到分析柱中。用紫外分光光度計(jì)對(duì)捕獲的HRP-anti-AFP的活性進(jìn)行了檢測(cè)。最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，AFP濃度在5～120 ng mL-1和300～1000 ng