鈣霉素合成基因(calD)的功能研究及相關(guān)蛋白復(fù)合物的初探.pdf

1、鈣霉素（Calcimycin）是一類含有吡咯環(huán)的聚醚類抗生素，廣泛用于細胞二價陽離子的生物學(xué)功能研究?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)包括三部分：吡咯環(huán)、螺旋環(huán)及含有取代基團的苯丙噁唑環(huán)。分子內(nèi)部并列排列著許多氧原子而帶負電，外部由疏水烴類構(gòu)成，因此鈣霉素作為一種二價陽離子載體嵌入膜內(nèi)進行細胞膜內(nèi)外鈉鉀等離子的運輸并且可以特異螯合二價金屬陽離子（Ca2+、Mg2+），被廣泛應(yīng)用于二價陽離子穿膜時生物屬性的研究，另外，鈣霉素還具有抗真菌、抗部分革蘭氏陽性菌、誘導(dǎo)

2、細胞凋亡等生物活性，同時它可以抑制ATPase活性從而抑制ATP的水解，同時還是哺乳動物細胞氧化磷酸化的一種解偶聯(lián)劑。因此鈣霉素在生物基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究領(lǐng)域具有重要價值。自鈣霉素發(fā)現(xiàn)以來，已有16,000多篇文獻對其進行報道。
　　Streptomyces chartreusis NRRL3882為鈣霉素產(chǎn)生菌。前期用同位素標記的脯氨酸、乙酸、甲酸、3-羥基鄰氨基苯甲酸和甲硫氨酸進行喂養(yǎng)實驗,揭示了鈣霉素骨架結(jié)構(gòu)的生物合成前體來源

3、。鈣霉素的生物合成基因簇于2011年被成功克隆。鈣霉素的整個生物合成途徑已經(jīng)成功得到推導(dǎo)，部分基因功能已得到確定。
　　為確認功能未知基因calD，預(yù)將基因calD克隆到鈣霉素產(chǎn)生自身菌教酒鏈霉菌NRRL3882中，同時引入Flag標簽以便下游的蛋白純化。HPLC檢測分析回補菌株、野生菌株和突變菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，回補菌株恢復(fù)了鈣霉素產(chǎn)生能力，確定calD基因回補成功，同時說明Flag標簽的引入不會影響教酒鏈霉菌中鈣霉素的合成。從鈣霉

4、素表達量、菌體量和菌體破碎難易程度三個方面在發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵時間兩個參數(shù)上進行條件優(yōu)化，以期提高目的蛋白得率。最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為YEME培養(yǎng)基，最佳發(fā)酵時間為10天，并進行后續(xù)的大規(guī)模發(fā)酵工作。Western blotting實驗確認Flag標簽融合蛋白CalD-Cflag在鏈霉菌中的成功表達，生物信息學(xué)預(yù)測CalD蛋白屬于氧化還原酶超家族，HPLC結(jié)果顯現(xiàn)calD基因的缺失導(dǎo)致突變株鈣霉素產(chǎn)生能力大大低于野生菌株，高分辨質(zhì)譜和二

5、級質(zhì)譜結(jié)果顯示突變株中積累了多于野生菌株的3-Hydroxylcezomycin，因此calD基因的缺失阻斷了3-Hydroxylcezomycin的大部分轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致突變株內(nèi)3-Hydroxylcezomycin的積累。生物信息學(xué)預(yù)測CalD蛋白屬于氧化還原酶家族，因此推測CalD蛋白酶可能負責催化苯丙噁唑環(huán)上3’羥基的氧化，氧化產(chǎn)物可能為酮基化合物，即3-Ketocezomycin。
　　從鈣霉素基因簇上克隆到聚酮合酶（PKS）

6、基因：calA1、calA2、calA3、calA4、calA5，構(gòu)建了九種重組病毒：AcNPV-CalA1，AcNPV-CalA2,AcNPV-CalA3,AcNPV-CalA4,AcNPV-C5,AcNPV-CalA1 His,AcNPV-CalA2StrepII,AcNPV-CalA3StrepIII，AcNPV-CalA4Flag。桿狀病毒表達系統(tǒng)表達蛋白，親和層析嘗試小體積蛋白純化，并得到部分聚酮合酶蛋白，證明了昆蟲細胞-桿狀