重組人胰激肽原酶發(fā)酵及復性研究.pdf

1、胰激肽原酶(Kallidinogenase，KLK)遍布于人體當中，是人體KKS系統(tǒng)的重要組成成分，能夠起到抑制血小板凝聚，改善血液循環(huán)和降低血壓效果，廣泛用于治療糖尿病，心腦血管，高血壓等疾病。本實驗重點放在重組人胰激肽原酶的初步發(fā)酵優(yōu)化以及KLK包涵體的變復性工藝。
　　 采用單因素的實驗方法，研究了影響重組人KLK表達的條件，結(jié)果表明:誘導劑IPTG的最適濃度為0.6mmol·L-1;最佳的誘導時間為4h;最佳的Amp的濃

2、度選擇為60g·L-1;最佳的培養(yǎng)溫度為37℃;最佳的酵母抽提物含量為10g·L-1;最佳的胰蛋白胨含量為18g·L-1。在此條件下，最終可以得到4.62g·L(-)1的包涵體。
　　 對重組KLK工程菌進行IPTG誘導表達，目的蛋白以包涵體形式存在;超聲破碎工程菌釋放包涵體，經(jīng)3次洗滌后純度達到71.93％;包涵體溶于含8MUrea的變性溶液中，濃度可達1731μg·mL-1。
　　 進行包涵體稀釋復性實驗，三個不同的

3、終濃度，181.51μg·mL-1;64.23μg·mL-1;39.14μg·mL-1，酶活分別達到0.85U·mg-1;7.68U·mg-1;11.24U·mg-1。在50μg·mL-1的濃度范圍中，酶活最高。
　　 一步透析法和多步透析法實驗，KLK的終濃度分別達到84.52μg·mL-1，75.42μg·mL-1，酶活達到0.63U·mg-1，3.13U·mg-1。
　　 采用柱層析法完成KLK包涵體復性:選用Se

4、phadex-G75進行凝膠過濾復性，柱子堵塞，洗脫不穩(wěn)定，無法完成復性;采用Urea梯度凝膠過濾色譜（Sephadex-G75），優(yōu)化尿素梯度的長度，在10％，20％，30％梯度長度下，蛋白回收率分別達到64.27％，75.68％，71.26％，酶活達到23.21U·mg-1，48.61U·mg-1，38.27U·mg-1。最優(yōu)的梯度長度是20％，此條件下得到的酶活高于稀釋復性和透析復性的酶活;采用離子交換色譜對KLK復性，酶活較低，