擬南芥EDR2定位、Ca結(jié)合特性和在Ca依賴性生長中的生理功能研究.pdf

1、鈣是植物生長發(fā)育必需礦質(zhì)元素之一。目前Ca相關(guān)植物生物學(xué)研究主要集中在兩個(gè)方面:植物細(xì)胞吸收和儲(chǔ)存Ca2+的分子機(jī)制;細(xì)胞質(zhì)Ca2+作為第二信使介導(dǎo)植物內(nèi)源和環(huán)境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)理。但是Ca2+直接調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的分子機(jī)理尚未深入研究。
　　擬南芥EDR2（ENHANCED DISEASE RESISTANCE2）蛋白含有三個(gè)預(yù)測結(jié)構(gòu)域:PH（Pleckstrin Homology）、START(STAR Transfer)和D

2、UF1336(Domain of Unknown Function1336)。已有研究證明缺失AtEDR2的擬南芥突變體atedr2的葉片通過水楊酸途徑表現(xiàn)抗白粉菌的表型。但是有關(guān)AtEDR2蛋白確切的亞細(xì)胞定位和在植物Ca2+依賴性生長方面的功能尚未有報(bào)道。本論文在這些方面的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1) AtEDR2啟動(dòng)子活性主要集中在葉、根、花序和角果柄組織。在葉片表面的表皮毛中也有強(qiáng)活性，但缺失AtEDR2基因?qū)M南芥葉表

3、面表皮毛的密度和性狀沒有明顯影響。通過構(gòu)建編碼AtEDR2全長和不同結(jié)構(gòu)域同綠色熒光蛋白GFP的融合基因，在煙草瞬時(shí)表達(dá)以后發(fā)現(xiàn)，AtEDR2定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可以同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白ER∷mCherry共定位。同時(shí)AtEDR2的PH結(jié)構(gòu)域是AtEDR2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位必需結(jié)構(gòu)域。
　　(2)通過對(duì)比擬南芥野生型Col和atedr2突變體在含有不同濃度和種類的礦質(zhì)元素培養(yǎng)基上的生長，我們發(fā)現(xiàn)atedr2只有在Ca2+養(yǎng)分缺乏的培養(yǎng)基上表現(xiàn)葉和

4、根生長被顯著抑制的表型，證明AtEDR2特異性調(diào)節(jié)擬南芥Ca2+依賴性根和葉的生長。無論生長在全營養(yǎng)還是Ca2+缺乏培養(yǎng)基上，擬南芥Col和atedr2的根和葉的總鈣以及水溶性鈣含量沒有顯著差異。這說明atedr2低Ca2+敏感的生長表型不是因?yàn)槠湮栈蚴欠e累Ca2+能力降低而導(dǎo)致的。我們?cè)隗w外表達(dá)純化了帶有GST(Glutathione-S-Transferase)標(biāo)簽的AtEDR2結(jié)構(gòu)域片段，利用MicroCal iTC200微量熱

5、等溫滴定量熱儀，證明AtEDR2的PH結(jié)構(gòu)域具有Ca2+結(jié)合特性。有研究證明AtEDR2的PH結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合磷脂酰肌醇-4-磷酸PI4P，本研究的組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明AtEDR2不參與PI4P的分布，很有可能是通過PH結(jié)構(gòu)域的Ca結(jié)合特性調(diào)節(jié)Ca依賴生長。
　　(3)基于蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，我們對(duì)在Col和atedr2之間、豐度顯著變化蛋白對(duì)應(yīng)的基因突變體進(jìn)行純合鑒定，進(jìn)一步進(jìn)行Ca依賴的生長表型分析，發(fā)現(xiàn)只有atstt3b基因缺失突變

6、體同atedr2一樣，表現(xiàn)低Ca敏感表型。AtSTT3B基因被預(yù)測編碼位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的低聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)原生蛋白最初的糖基加載過程。盡管低Ca處理確實(shí)可以顯著提高總蛋白N-糖基化水平，但是，無論是生長在全營養(yǎng)還是Ca2+缺乏培養(yǎng)基上，擬南芥Col和atedr2突變體之間，總蛋白N-糖基化程度沒有區(qū)別。證明AtEDR2不參與低鈣脅迫對(duì)蛋白N-糖基化的調(diào)節(jié)。
　　(4)基于芯片的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，低Ca處理誘導(dǎo)大量和過氧化物以及

7、水楊酸積累相關(guān)基因的表達(dá)。組織化學(xué)染色也證明在低Ca的情況下，atedr2突變體的葉片比野生型Col積累更多的過氧化氫。同時(shí)這些基因的轉(zhuǎn)錄水平在atedr2突變體內(nèi)升高的倍數(shù)顯著高于野生型Col，證明AtEDR2負(fù)調(diào)控低Ca誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在atedr2-6/ein2-1雙突變體中，阻斷atedr2-6突變體內(nèi)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)atedr2-6在低Ca條件下生長受抑制的表型沒有影響。但是阻斷水楊酸的合成可以部分恢復(fù)atedr2-6在