藥物與糖蛋白、細胞膜、細菌相互作用的毛細管電泳方法研究.pdf

1、生物大分子、靶體、細胞與藥物相互作用研究是現(xiàn)代高通量藥物篩選的重要基礎，毛細管電泳是研究分子間相互作用的重要技術(shù)手段之一。為了更好地了解生物分子與小分子間的相互作用，本論文以細胞內(nèi)的生物成分（糖蛋白）、細胞部分組織（細胞膜）以及完整的細胞（細菌）為研究對象，采用不同模式的毛細管電泳方法，對生物分子與藥物間的特異性相互作用及非特異性相互作用進行了系統(tǒng)性研究。研究內(nèi)容主要包括三部分：
　　第一部分：以生物大分子糖蛋白為受體，基于硼酸基

2、團與順式二羥基化合物的特異性絡合作用，研究了糖蛋白與硼酸間的特異性相互作用機理及其應用。
　　首先，采用毛細管電泳等電聚焦-整體柱成像檢測(CIEF-WCID)實時在線研究了硼酸與糖蛋白的特異性相互作用機理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加上電壓后，載體兩性電解質(zhì)在毛細管分離柱上形成不同的pH梯度，從而為硼酸與糖蛋白的相互作用創(chuàng)造不同的pH環(huán)境。當硼酸濃度增大到0.05 mol/L時，在電泳譜圖中可以直觀地看到硼酸與去唾液酸胎球蛋白產(chǎn)生的復合物的峰。

3、同時，通過實時監(jiān)測硼酸與去唾液酸胎球蛋白相互作用過程，發(fā)現(xiàn)硼酸與去唾液酸胎球蛋白復合物的峰一直往高pH位置遷移，在監(jiān)測的50 min里，復合物峰從pH=5.88的位置逐漸遷移到pH=8.22的位置，這一規(guī)律正好符合了硼酸與糖蛋白親和作用的工作機理。WCID具有信息量大、實時獲得各組分的動態(tài)信息、分析時間短及高通量等優(yōu)點，可獲取更多相互作用的重要信息，是相互作用研究的一個重要手段。
　　接著，利用硼酸與糖蛋白的特異性相互作用機制，選

4、擇兩種不同孔徑大小的氨基苯硼酸為涂層萃取材料，建立了一種選擇性萃取糖蛋白的固相微萃取方法，并采用CIEF-WCID對萃取后的樣品進行了快速分析檢測。在最優(yōu)化條件下，從標準緩沖液、磷酸鹽體系、血漿和血液等不同基質(zhì)中萃取及富集糖蛋白。
　　第二部分：以紅細胞膜為研究對象，采用峰漂移法及動力學毛細管電泳兩種模式研究了藥物與細胞膜相互作用的過程，建立了基于毛細管電泳測定藥物與細胞膜相互作用參數(shù)的方法。
　　首先，以細胞膜在毛細管內(nèi)構(gòu)

5、成假固定相，采用親和毛細管電泳研究細胞膜與藥物的相互作用。以西酞普蘭和兔紅細胞膜為相互作用模型，以不同濃度的細胞膜混懸液為電泳緩沖液，采用峰漂移法，并結(jié)合Scatchard分析，測得西酞普蘭、依匹斯汀與兔紅細胞膜的結(jié)合常數(shù)。該方法簡單、快速，為研究藥物與細胞膜的相互作用提供了新的技術(shù)手段，為高通量篩選藥物膜通透性和活性，以及評價藥物在體內(nèi)吸收提供一種新的方法。
　　在研究細胞膜與藥物相互作用的過程中，發(fā)現(xiàn)藥物在跨膜轉(zhuǎn)運過程中存在動

6、力學過程。于是，在區(qū)段-區(qū)段動力學毛細管電泳（ppKCE）的理論基礎上，以兔紅細胞膜、人紅細胞膜為受體，首次同時測得了表征西酞普蘭、加替沙星、羅沙替丁、西替利嗪與細胞膜間結(jié)合快慢的正向結(jié)合速率常數(shù)kon、反向解離速率常數(shù)kof、以及配體與受體間相互作用的結(jié)合常數(shù)Kb。實驗中考察了遷移時間及峰高的穩(wěn)定性，pH值對藥物與細胞膜相互作用動力學參數(shù)的影響。該方法為評價藥物療效、毒性及藥物動力學研究提供一種新的方法。
　　第三部分，以完整細

7、胞——細菌作為生物大分子受體，采用毛細管電泳研究了細菌與抗菌藥物間的特異性相互作用。
　　先采用ppKCE方法測定藥物與細菌相互作用的解離速率常數(shù)。首先優(yōu)化電泳條件，對樣品檢測波長、藥物與大腸桿菌的荷電性、緩沖液濃度、pH值進行了選擇；在最優(yōu)化實驗條件下，利用出峰時間及峰高求得大腸桿菌與6種抗菌藥間的解離速率常數(shù)。結(jié)果表明不同作用機制的抗生素與大腸桿菌相互作用的解離速率常數(shù)各不相同，同種作用機制的抗生素與大腸桿菌相互作用的解離速率

8、常數(shù)強度相近。該方法對藥物在體內(nèi)藥物代謝動力學，藥物效應動力學以及藥物敏感性實驗的評價具有一定的指導意義。
　　然后，基于喹諾酮類藥物與細菌間特異性抗菌機制，首次采用區(qū)段灌注毛細管電泳技術(shù)，以大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌為手性選擇劑對氧氟沙星對映異構(gòu)體進行拆分。首先優(yōu)化了緩沖液離子強度、pH值、分離電壓以及細菌灌注時間等分離條件，結(jié)果表明，3種細菌對氧氟沙星對映體均有立體選擇性，且在7 min內(nèi)成功實現(xiàn)了大腸桿菌、銅綠假

9、單胞菌對氧氟沙星的基線分離，結(jié)果也說明了氧氟沙星對革蘭氏陰性菌的抗菌作用效果要強一些。同時采用左氧氟沙星、撲爾敏、西替利嗪、細胞膜對分離結(jié)果進行了陰性對照實驗。建立了一種依據(jù)細菌與手性抗菌藥間的高度立體選擇性，以細菌為手性拆分劑對抗生素對映體進行拆分的新方法，該方法具有生物樣品用量少、拆分時間短等優(yōu)點，為抗生素的手性拆分開拓了一種新的方法。
　　論文以糖蛋白、細胞膜和細菌為研究對象，由生物大分子到完整細胞，從對糖蛋白與小分子間的相