新型硫酸軟骨素-硫酸皮膚素內(nèi)切型硫酸酯酶4-O-endosulfatase的作用模式研究.pdf

1、硫酸軟骨素(CS)和硫酸皮膚素(DS)都是線性陰離子粘多糖，廣泛存在于細(xì)胞表面、細(xì)胞基質(zhì)和結(jié)締組織中。在生物體內(nèi)CS和DS常交替存在(CS/DS)，不僅是重要的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，還具有一系列重要生物學(xué)功能。這是通過多糖鏈中具有特殊結(jié)構(gòu)的功能區(qū)與特定受體蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)的。越來越多的研究表明，CS/DS的硫酸化模式在其各種生物學(xué)功能中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　CS/DS硫酸酯酶(Sulfatase)是一類專一性水解去除糖鏈中特定部位硫酸基團(tuán)的

2、酶，其蛋白質(zhì)序列具有一定保守性，可分為外切型和內(nèi)切型硫酸酯酶。外切酶只對(duì)CS/DS糖鏈末端的硫酸基團(tuán)具有脫去作用，而內(nèi)切型硫酸酯酶對(duì)糖鏈末端和內(nèi)部的硫酸基團(tuán)均有脫去作用。因此，內(nèi)切型CS/DS硫酸酯酶不僅可用于制備結(jié)構(gòu)均一的CS/DS多糖或寡糖，也是分析糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的重要工具，對(duì)相關(guān)疾病的研究和治療具有重要價(jià)值。
　　最近，本課題組報(bào)道了一種來自海洋細(xì)菌Vibrio sp.FC509的新型內(nèi)切型CS/DS硫酸酯酶(4-O-end

3、osulfatase)，這是從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的首個(gè)糖胺聚糖硫酸酯酶。該酶能以多種CS/DS糖鏈為底物，專一性降解4-位硫酸基團(tuán)，效率為17-65％。但是，該酶的脫硫酸基模式尚不完全清楚。因此，本論文制備了一系列不同硫酸化模式的CS六糖，并分析了結(jié)構(gòu)特征，用重組酶4-O-endosulfatase與結(jié)構(gòu)明確的六糖和八糖分別進(jìn)行反應(yīng)，初步地分析了酶的作用模式。
　　具體如下:
　　1.不同硫酸化模式CS六糖的制備:用HCLas

4、e部分降解CS-A和CS-E多糖，通過凝膠過濾層析制備二糖到十二糖;用陰離子交換柱YMC-Pack PolyamineⅡ?qū)θ∷玫腃S-A和CS-E六糖進(jìn)行亞分級(jí)，以獲得硫酸化模式不同的六糖;最后，用陰離子柱YMC-Pack PA-G所得的六糖組分進(jìn)行純化，將純化所得六糖進(jìn)行2-氨基苯甲酰胺(2-AB)標(biāo)記，用HPLC分析純度，得到十四個(gè)高純的六糖。
　　2.不同硫酸化模式六糖的結(jié)構(gòu)分析:將純化所得十四種六糖純品分別與過量的CSa

5、se ABC反應(yīng)，然后用2-AB標(biāo)記寡糖產(chǎn)物，最后通過HPLC分析每種六糖的二糖組成特征;將2-AB標(biāo)記的每種六糖用CSase ABC降解，產(chǎn)物二次標(biāo)記，最后通過HPLC分析其非還原端結(jié)構(gòu);將2-AB標(biāo)記的每種六糖用HCDase降解，通過HPLC分析其還原端的二糖結(jié)構(gòu)。根據(jù)上述結(jié)果，確定了所得十四種六糖的糖鏈序列信息，其中硫酸化模式特異且結(jié)構(gòu)均一的CS六糖有十三種。
　　3.4-O-endosulfatase的作用模式研究:1）4

6、-O-endosulfatase與硫酸化模式不同的六糖或八糖進(jìn)行作用，發(fā)現(xiàn):不論HexUA1-3GalNAc(4S)位于六糖糖鏈的非還原端、還原端或內(nèi)部，該糖單元中的4-位硫酸基團(tuán)均能被徹底脫去;然而，無論二硫酸化的HexUA1-3GalNAc(4S，6S)位于六糖鏈的非還原端或內(nèi)部，其4-位硫酸基團(tuán)均不能脫去;當(dāng)4-O-endosulfatase與八糖△4,5HexUAα1-3GalNAe(6S)β1-4GlcAβ1-3GalNAc(

7、4S)β1-4GlcA(2S)β1-3GalNAc(6S)β1-4GlcAβ1-3GalNAc(6S)作用時(shí)，4-位硫酸基團(tuán)不能脫去，提示HexUA(2S)1-3GalNAc(6S)的存在能抑制酶的活性。2）用4-O-endosulfatase對(duì)結(jié)構(gòu)為Δ4,5HexUAα1-3GalNAc(4S)β1-4GlcAβ1-3GalNAc(4S)β1-4GlcAβ1-3GalNAc(4S)的六糖進(jìn)行處理，隔時(shí)取樣，分析產(chǎn)物的脫硫酸基情況，發(fā)現(xiàn)

8、產(chǎn)物所含硫酸基團(tuán)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步減少，直至被完全去除;對(duì)其中脫去單個(gè)硫酸基團(tuán)的中間產(chǎn)物進(jìn)行糖鏈分析，發(fā)現(xiàn)其還原端二糖單元不含硫酸根，這提示該酶從糖鏈的還原端開始、依次向非還原端脫去4-位硫酸基團(tuán)。
　　綜上，本論文用凝膠過濾層析和離子交換層析制備了十三種硫酸化模式特異且結(jié)構(gòu)均一的CS六糖，用酶法測(cè)定了糖鏈序列，并以糖鏈序列確定的六糖和八糖為底物分別與酶進(jìn)行作用，初步揭示了4-O-endosulfatase的作用模式，這為CS/DS復(fù)