近膜區(qū)域熒光顯微圖像中亞細胞目標的斑點檢測、融合事件識別和三維形態(tài)重建.pdf

1、隨著光學顯微技術的進步，全內反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescencemicroscopy，TIRFM)相比于傳統(tǒng)的生物醫(yī)學研究方法（如免疫細胞化學、基因技術、亞細胞分層等）能夠實時觀察細胞膜附近區(qū)域內的亞細胞目標（如轉運囊泡、自噬溶酶體、細胞骨架等），并定量分析其結構形態(tài)和動態(tài)運動特性（如微管結構，胞吞胞吐過程中的囊泡運動、細胞遷移等）。但由于所觀察的對象特征復雜、運動模式多變，人工分

2、析海量的TIRFM圖像數(shù)據不僅十分繁瑣，分析結果錯誤率往往較高。因此，利用計算機圖像處理技術對顯微圖像進行自動分析，并提供客觀的定量數(shù)據幫助量化并驗證所觀察到的生命活動就顯得尤為重要。
　　細胞膜附近區(qū)域葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter，Glut)囊泡的運動情況和徽管細胞骨架的結構形態(tài)與葡萄糖轉運機制密切相關。針對近膜區(qū)域內常見的Glut4囊泡、自噬溶酶體以及微管細胞骨架等亞細胞目標的TIRFM圖像，本論文開

3、展如下工作:熒光顯微圖像降噪，顯微圖像中特征斑點的檢測，Glut4囊泡與細胞質膜融合過程的自動識別，以及利用多角度TIRF成像技術重建微管在近膜區(qū)域的三維形態(tài)。論文主要成果及創(chuàng)新點包括:
　　(1)在分析熒光顯微圖像形成的基礎上，提出基于小波多尺度求和(wavelet multiscaleaddition，WMA)的圖像降噪方法。不同信噪比的模擬圖像實驗結果表明相對于線性濾波，高斯平滑濾波以及小波多尺度方差穩(wěn)定變換算法，WMA算法

4、擁有更優(yōu)的降噪效果。WMA算法在C2C12骨骼肌細胞Glut4囊泡和微管圖像中的降噪效果也得到了驗證。
　　(2)建立了根據熒光斑點的亮度均值和方差構建特征空間實現(xiàn)顯微圖像中的特征斑點檢測(feature particle detection，F(xiàn)PD)算法。模擬圖像實驗結果表明在信噪比很低(SNR=1)時，F(xiàn)PD算法的準確檢測率仍能達到87％。在胸主動脈平滑肌細胞自噬溶酶體的檢測中，F(xiàn)PD算法優(yōu)于ImageJ軟件自帶的Analyz

5、e articles(AP)算法，與人工識別效果的擬合度達到93％。
　　(3)基于pH值敏感性熒光蛋白VAMP2-pHluorin標記Glut4囊泡，應用移動平均差分算法結合自適應閾值（中值絕對偏差）能從TIRF圖像序列中檢測出備選Glut4融合囊泡并確定融合起始幀數(shù)。通過對備選Glut4融合囊泡進行逐幀二維Gaussian擬合，得到融合過程中囊泡的參數(shù)變化情況，以此判斷備選Glut4囊泡融合過程屬于完全融合(fullfusio

6、n)還是部分融合（partial fusion）。三組已知真實融合信息的3T3-L1脂肪細胞TIRF圖像序列用于驗證識別算法的有效性。實驗結果表明備選Glut4融合囊泡準確檢測率達到96.5％，融合過程準確識別率達到84.3％。
　　(4)結合多角度TIRF顯微技術得到圖像的更多空間深度信息，擬合不同入射角下激光的透射強度，實現(xiàn)了觀察目標的三維形態(tài)重建。實驗結果表明在信噪比為2時，探測深度在300nm范圍內的定位精度能達到40nm