發(fā)酵法制備黑木耳色素及其功能特性研究.pdf

1、黑木耳屬于藥食兩用真菌，其子實(shí)體長期以來被人們普遍食用。黑木耳子實(shí)體含有對人體具有生理作用的黑色素。黑色素是由多酚和吲哚等化合物氧化聚合而成，呈紅、黑或紅棕等顏色，具有抗氧化、抗病毒、抗衰老和增強(qiáng)人體免疫力等保健功能，是極具發(fā)展?jié)摿Φ奶烊还δ苄允称分珓?。但由于黑木耳子?shí)體生長周期長、黑色素提取工藝復(fù)雜、成本高而未見利用黑木耳色素的報(bào)道。采用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)黑木耳色素具有周期短、成本低、產(chǎn)量高和便于分離純化等特點(diǎn)。
　　 本研

2、究篩選高產(chǎn)黑色素的黑木耳菌種，探討發(fā)酵法形成黑木耳色素的條件以及碳水化合物對酪氨酸酶和黑色素形成的影響;分離純化黑木耳酪氨酸酶，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究;采用搖瓶補(bǔ)料添加酪氨酸的方法制備黑木耳色素，并與子實(shí)體黑色素進(jìn)行理化性質(zhì)和穩(wěn)定性比較;采用凝膠柱層析分離黑木耳發(fā)酵液黑色素各組分，比較色澤、分子量和結(jié)構(gòu)組成等，并分析其抗氧化活性以及抗紫外線輻射能力。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、從22株黑木耳菌種中篩選得到RF201為黑木耳產(chǎn)黑

3、色素的優(yōu)良菌株。通過發(fā)酵試驗(yàn)，確定黑色素產(chǎn)量與酪氨酸酶活力呈極顯著正相關(guān)（r=0.622，P＜0.01），與碳水化合物含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（總糖，r=-0.607，P＜0.01;還原糖，r=-0.956，P＜0.01）。酪氨酸酶是黑木耳色素形成過程中的關(guān)鍵酶，酪氨酸含量在一定程度上決定黑色素產(chǎn)量。
　　 2、通過硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephadex G-100葡聚糖凝膠和DEAE-Sephcrose-FF離子交換層析，分離并純化了黑木

4、耳發(fā)酵液中的酪氨酸酶，SDS-PAGE電泳圖譜呈單一條帶，較粗酶液純化21.43倍，比活力達(dá)到1285.82 U/mg，回收率為27.41％。
　　 通過SDS-PAGE測定，黑木耳酪氨酸酶的蛋白亞基分子量為12.62 kDa。該酶最適pH為7.0，在中性和堿性條件下穩(wěn)定;最適溫度為40℃，60℃以上高溫在短時(shí)間內(nèi)使其失活。
　　 黑木耳酪氨酸酶具有很強(qiáng)的底物專一性，可催化酪氨酸、多巴、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚和沒食

5、子酸等發(fā)生反應(yīng)，但對苯丙氨酸、半胱氨酸和阿魏酸等沒有催化作用。金屬鹽中CuSO4對酪氨酸酶有激活作用，Al(NO3)3和MgSO4則起抑制作用。表面活性劑Tween-80、Triton X-100和EDTA對酪氨酸酶活力均有抑制作用，而SDS在低濃度時(shí)具有促進(jìn)作用，高濃度時(shí)則起抑制作用。分別以酪氨酸、多巴和鄰苯二酚為底物，酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的Km分別為5.88、4.06和1.94 mmol/L，Vmax分別為64.10、42.74和21.51

6、μmol/min。
　　 3、碳源中的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖和可溶性淀粉均對酪氨酸酶的合成有抑制作用，而天然復(fù)合物中的麥麩汁、氮源中的干酪素和無機(jī)鹽中的硫酸銅對酪氨酸酶產(chǎn)量具有顯著促進(jìn)作用。采用中心組合試驗(yàn)獲得最優(yōu)培養(yǎng)基組成為:麥麩汁36％、干酪素1.1 g/L、硫酸銅0.13 g/L。在此條件下，酪氨酸酶最大活力為17.22 U/mL，比優(yōu)化前培養(yǎng)基中酪氨酸酶活力提高2.1倍。
　　 Plackett-Bur

7、man試驗(yàn)篩選結(jié)果表明，發(fā)酵條件中的時(shí)間、裝液量、接種量和起始pH是對酪氨酸酶產(chǎn)量有顯著影響的因素，經(jīng)中心組合試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化后，得到黑木耳產(chǎn)酪氨酸酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為:時(shí)間3.47 d、裝液量52.92 mL、接種量7.39％和起始pH7.9。在此條件下，酪氨酸酶的最大產(chǎn)量為22.69 U/mL，與預(yù)測值相符。
　　 采用黑木耳搖瓶補(bǔ)料分批發(fā)酵技術(shù)制備黑色素時(shí)，酪氨酸最適添加時(shí)間為2d、添加量為1 g/L、補(bǔ)加時(shí)間為4d、補(bǔ)加量為

8、1.5 g/L，在此條件下，酪氨酸的轉(zhuǎn)化率為41.42％，黑色素產(chǎn)量達(dá)到1035.71 mg/L。
　　 4、黑木耳發(fā)酵液黑色素在表觀色澤上比子實(shí)體黑色素更趨近于黑色。兩種黑色素均不溶于水和常見的有機(jī)溶劑，僅溶于堿性溶液，且在pH小于3的酸性溶液中產(chǎn)生沉淀。黑木耳發(fā)酵液和子實(shí)體黑色素都能被氧化劑氧化漂白，而對還原劑穩(wěn)定。在紫外可見光譜范圍內(nèi)兩者均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸收特性。
　　 黑木耳發(fā)酵液黑色素和子實(shí)體黑色素均易溶于堿性溶

9、液，在高pH環(huán)境中穩(wěn)定;兩者對溫度和光照敏感，隨強(qiáng)度的提高和時(shí)間的延長，損失變大;Zn2+、Cu2+、Fe3+和Fe2+等金屬離子可降低黑木耳色素的穩(wěn)定性。兩種黑木耳色素在白砂糖和檸檬酸溶液中不穩(wěn)定，但在其它食品添加劑溶液中較穩(wěn)定。
　　 5、采用Sephadex G-100柱層析獲得黑木耳發(fā)酵液黑色素F1和F2兩組分，分子量分別為404.97和20.69 kDa，兩者在紫外可見區(qū)域都有強(qiáng)烈的吸收。F1比F2具有更低的L*、b*

10、、C*和h(°)，在外觀色澤上更趨近于黑色。
　　 元素分析表明:F1和F2都含有C、H、N、O和S元素，屬于棕黑色素。紅外色譜和核磁氫譜表明F1和F2的結(jié)構(gòu)中均含有大量的羥基、羰基和芳環(huán)基團(tuán)。經(jīng)氧化降解測得F1中5，6-二羥基-2-吲哚羧酸占43.22％、5，6-二羥基吲哚占9.78％; F2中5，6-二羥基-2-吲哚羧酸占69.04％、5，6-二羥基吲哚占17.47％。
　　 6、黑木耳色素組分F1和F2均具有較強(qiáng)的