多重PCR技術(shù)和重組DNA技術(shù)在水產(chǎn)品安全中的應(yīng)用.pdf

1、我國(guó)是水產(chǎn)品生產(chǎn)、消費(fèi)和輸出大國(guó)，水產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題關(guān)系到我國(guó)廣大人民群眾的生命健康，關(guān)系到經(jīng)濟(jì)健康發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定，關(guān)系到政府和國(guó)家的形象。同時(shí)，由于我國(guó)傳統(tǒng)的水產(chǎn)業(yè)發(fā)展模式落后，整體生產(chǎn)力水平低下，高密度的養(yǎng)殖環(huán)境導(dǎo)致大量致病菌迅速繁殖；為了防治這些致病菌，濫用抗生素現(xiàn)象嚴(yán)重，再加上水環(huán)境污染越演越烈，有毒物質(zhì)通過(guò)食物鏈在水產(chǎn)品體內(nèi)大量蓄積，水產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題嚴(yán)重威脅到廣大人民群眾的利益。因此，在今后相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，水產(chǎn)品的安全檢測(cè)和

2、質(zhì)量控制將是我們面臨的一個(gè)重要課題。
　　 本研究?jī)?nèi)容分兩部分。第一部分針對(duì)水產(chǎn)品中日益復(fù)雜的食源性致病菌的混合污染，建立了一種能同時(shí)、準(zhǔn)確、快速檢測(cè)多種常見(jiàn)食源性致病菌的多重PCR方法。沙門(mén)氏菌(Salmonella)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是我國(guó)水產(chǎn)品中引起食源

3、性疾病及食物中毒的重要致病菌。傳統(tǒng)的微生物鑒定方法需分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定等多個(gè)步驟，操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低，而且每次只能檢測(cè)出一種致病菌。本研究根據(jù)沙門(mén)氏菌的侵染上皮細(xì)胞表面蛋白基因(invA)、單核細(xì)胞增生李斯特菌的侵入關(guān)聯(lián)蛋白基因(iap)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)和副溶血性弧菌的耐熱直接溶血素基因(tdh)分別設(shè)計(jì)四對(duì)特異性引物，并以細(xì)菌16SrRNA基因的部分保守序列為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)對(duì)退火溫度、引物

4、濃度等反應(yīng)參數(shù)的調(diào)整和優(yōu)化，建立了如下多重PCR方法：10×PCRbuffer2.0μL(含Mg2+)、dNTP200μmol/L、DNA模板1μL、TaqDNA聚合酶2.5U，引物濃度分別為：16SrRNA200nmol/L、tdh250nmol/L、nuc300nmol/L、iap350nmol/L、invA250nmol/L，加無(wú)菌水至總體積為20μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min、94℃變性30s、57℃退火40s、72℃延伸

5、1min、72℃延伸10min，反應(yīng)共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。為了檢驗(yàn)該方法的可行性，進(jìn)一步對(duì)人工接種上述四種病原菌的南美白對(duì)蝦進(jìn)行了多重PCR檢測(cè)。研究結(jié)果表明：對(duì)污染樣品直接提取DNA和預(yù)增菌后提取DNA再進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，均能有效擴(kuò)增出各個(gè)目的片段；但預(yù)增菌處理后可使檢測(cè)限明顯降低，進(jìn)而大大提高了檢測(cè)的靈敏度。本研究建立的多重PCR方法為食品包括水產(chǎn)品中病原微生物的檢測(cè)提供了快速、靈敏和高效的檢測(cè)技術(shù)。
　　 第二部分針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)

6、殖中濫用抗生素的現(xiàn)象，擬通過(guò)重組DNA技術(shù)制備一種能替代傳統(tǒng)抗生素的、無(wú)殘留的新型廣譜抗菌飼料添加劑--抗菌肽?？咕氖怯缮锛?xì)胞特定基因編碼的一類(lèi)具有強(qiáng)抗菌作用的小分子多肽，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，在機(jī)體天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用。本研究對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)肝臟表達(dá)的抗菌肽(LEAP-2)的成熟肽基因進(jìn)行了cDNA克隆、測(cè)序及表達(dá)載體的構(gòu)建，為重組抗菌肽的制備奠定了重要的研究基礎(chǔ)。首先以已經(jīng)獲

7、取的LEAP-2全長(zhǎng)cDNA為模板，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ的雙向引物，擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為140bp的成熟肽區(qū)域的基因片段，命名為“mleap-2”，將其連接到pSURE-T克隆載體后進(jìn)行測(cè)序確證；選擇pET-30a作為表達(dá)載體，采用EcoRⅠ和HindⅢ分別對(duì)表達(dá)載體pET-30a和mleap-2目的片段進(jìn)行雙酶切，以期構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)PCR插入檢驗(yàn)和雙酶切鑒定證明pET30a-mleap-2重組表達(dá)質(zhì)粒已被成功構(gòu)建；經(jīng)