橙汁與柑橘園中脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離鑒定與檢測(cè)研究.pdf

1、脂環(huán)酸芽孢桿菌可造成巴氏滅菌的果汁腐敗，影響果汁的品質(zhì)，引起國(guó)際的關(guān)注，已成為果汁國(guó)際貿(mào)易技術(shù)壁壘的新內(nèi)容。國(guó)際貿(mào)易中嚴(yán)格要求每10 mL濃縮果汁中脂環(huán)酸算芽孢桿菌的含量小于1個(gè)。而我國(guó)在脂環(huán)酸芽孢桿菌分離、檢測(cè)方法等方面的研究較少，且僅側(cè)重于蘋(píng)果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究，對(duì)橙汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌研究較少。因此，對(duì)橙汁與柑橘園中脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離、鑒定與檢測(cè)技術(shù)這對(duì)我國(guó)橙汁生產(chǎn)和貿(mào)易都具有十分重要的意義。
　　 本文以柑橘園及不

2、同橙汁中分離得到的13株具有耐酸耐熱性的菌株為研究材料，首先對(duì)其進(jìn)行了菌落形態(tài)、培養(yǎng)基氣味、耐酸性、耐熱性、革蘭氏染色等常規(guī)檢測(cè)；隨后對(duì)分離菌株進(jìn)行了16S rDNA序列聚類(lèi)分析；研究了分離菌株的16S rDNA PCR-RFLP限制性酶切特征圖譜，并進(jìn)行了聚類(lèi)分析；此外，還根據(jù)脂環(huán)酸芽孢桿菌的16S rDNA設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性強(qiáng)，靈敏度高的引物。具體研究結(jié)果如下：
　　 (1)選用BAT培養(yǎng)基在45℃2～5 d的培養(yǎng)條件，從橙汁

3、及柑橘園中分別分離得到8株和2株脂環(huán)酸芽孢桿菌。因此，BAT培養(yǎng)基在45℃2～5 d的培養(yǎng)條件，可作為橙汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的選擇性培養(yǎng)基。
　　 (2)本研究以分離菌株NFC-1為研究材料，對(duì)其生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該菌經(jīng)過(guò)18 h培養(yǎng)后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在25 h菌體濃度能達(dá)到最高，隨后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。從而確定該菌的基因組DNA提取條件為：225 r/min45℃氣浴搖床培養(yǎng)25 h。
　　 (3)對(duì)13株分離菌與

4、3種脂環(huán)酸芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌的16S rDNA序列對(duì)比，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，橙汁中8株具有耐酸耐熱性的菌株均為脂環(huán)酸芽孢桿菌屬，其中1株Alicyclobacillus acidiphilus DSM14558，3株Alicyclobacillus acidoteresstris DSM3922，4株A.acidocaldcular柑橘園中有2株耐酸耐熱菌為Alicyclobacillus acidiphilus DSM14558

5、。
　　 (4)采用16S rDNA PCR-RFLP法對(duì)分離得到的13株耐酸耐熱性菌株與3種脂環(huán)酸芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，在87％的相似水平上，所有菌株分為5個(gè)種群和10個(gè)分支，其中P-1、P-5、K-1與標(biāo)準(zhǔn)菌A.acidiphilus DSM14558相似水平較高，可視為同一個(gè)種，即嗜熱脂環(huán)酸芽孢桿菌；H-1、ZH-1、ZH-2與A.acidoterrestrius DSM3922相似水平較高，可視為同一個(gè)

6、種，即酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌；NFC-1、NFC-2、NFC-4、NFC-10另分一支，NFC-4號(hào)菌經(jīng)克隆測(cè)序及序列比對(duì)，結(jié)果與嗜酸耐熱菌中的A.acidocaldarus序列同源性高達(dá)99％以上，說(shuō)明這4株菌均是酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌。此外，16S rDNA PCR-RFLP聚類(lèi)與16S rDNA序列分析聚類(lèi)結(jié)果較為一致，由此說(shuō)明本研究結(jié)果是可靠的。
　　 (5)根據(jù)16S rDNA屬間的高變區(qū)，種間的保守區(qū)，設(shè)計(jì)出一對(duì)針對(duì)脂環(huán)酸芽

7、孢桿菌的特異性強(qiáng)、靈敏度高的引物。通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)，得到最佳擴(kuò)增條件為：25μL擴(kuò)增體系中，ddH2O17.75μL，10×buffer2.5μL，25 mM Mg2+1.5μL，10 mM dNTP1.5μL，35L0.3μL，35R0.3μL，5U/ul Taq酶0.13μL，DNA模板1μL。擴(kuò)增條件為：94℃5 min；94℃40 s，59.8℃40 s，72℃40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃8 min。在最佳的擴(kuò)增程序下，PCR擴(kuò)增脂

8、環(huán)酸芽孢桿菌的基因組DNA最低量為10-4 pg，擴(kuò)增脂環(huán)酸芽孢桿菌的最低菌液濃度為3.0×103 CFU/mL。
　　 (6)成功建立了脂環(huán)酸芽孢桿菌的PCR快速檢測(cè)方法。該方法的整體體系為：20 mL橙汁→80℃13 min→10 mL接種于BAT培養(yǎng)液→225 r/min45℃的條件下氣浴振蕩培養(yǎng)25 h→采用CTAB法提取DNA→進(jìn)行PCR擴(kuò)增→瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物→結(jié)果判斷。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程約需要2～5 d，而傳統(tǒng)常規(guī)檢