中樞ADAM17介導(dǎo)膜上ACE2脫落在高血壓心血管功能調(diào)控中的作用研究.pdf

1、目的:
　　原發(fā)性高血壓病是一種人類常見的慢性病，它是以血壓升高為主要特征，并伴有血管、心臟等重要臟器并發(fā)癥的一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，發(fā)病率長期居高不下。有調(diào)查顯示，中國有23.3％的成年人約2.45億患有高血壓病，而根據(jù)2017年美國心臟病協(xié)會/美國心臟協(xié)會新修訂的高血壓標(biāo)準(zhǔn)（收縮壓≥130mmHg，舒張壓≥80mmHg），中國高血壓的患病率高達(dá)46.4％，而中國高血壓的控制率為17％。因此，對高血壓發(fā)病機理的研究和尋找更高

2、效的的治療策略，仍是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)界研究的熱點。高血壓病除外周心血管系統(tǒng)的一系列特征表現(xiàn)外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)交感輸出亢進(jìn)是高血壓病發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的眾多核團(tuán)中，頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla，RVLM)是調(diào)控交感輸出和基礎(chǔ)血壓的關(guān)鍵中樞，RVLM神經(jīng)元功能異常與高血壓和交感興奮性增高密切相關(guān)。
　　研究證實中樞腎素血管緊張系統(tǒng)(Renin-angiotensin sy

3、stem，RAS)過度激活是高血壓病中樞交感輸出的重要機制之一，增多的血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)可以降低中樞壓力敏感反射，增強中樞交感縮血管緊張性，導(dǎo)致血壓的異常增高。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin converting enzyme2，ACE2)是腎素血管緊張系統(tǒng)家族中的新成員，ACE2將血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)和AngⅡ轉(zhuǎn)化成血管緊張素-(1-7)[Angiotensin

4、(1-7)，Ang-(1-7)]，并拮抗AngⅡ的升壓效果而發(fā)揮作用，而RAS和ACE2相關(guān)軸之間的平衡對維持正常血壓和自主神經(jīng)功能的中樞調(diào)節(jié)非常重要。已有研究證實，原發(fā)性高血壓狀態(tài)下大鼠RVLM內(nèi)ACE2的表達(dá)顯著下降，而在該區(qū)域過表達(dá)ACE2可使血壓和腎交感活性顯著下降。因此，ACE2在中樞調(diào)控心血管功能中的作用十分顯著，也是當(dāng)前尋求新的高血壓防治策略的研究靶點之一，但目前高血壓中樞ACE2功能降低的機制尚不清楚。
　　細(xì)胞中

5、ACE2是Ⅰ型跨膜蛋白，由細(xì)胞外的N端結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)和一個短的胞內(nèi)C末端組成，細(xì)胞外液中可溶性ACE2的形式為缺乏其胞內(nèi)和跨膜結(jié)構(gòu)域的胞外部分。ACE2的作用功能目前研究較為廣泛，而上游對其調(diào)控的機理目前尚不清晰，研究較少。有研究顯示鑲嵌在細(xì)胞膜表面的解聚素和金屬蛋白酶17(A Disintegrin and Metalloproteases17，ADAM17)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞ACE2活性，ADAM17可以剪切細(xì)胞表面的多種蛋白質(zhì)，從而發(fā)

6、揮其多樣的生理功能。它在機體內(nèi)很多個器官都有表達(dá)，參與了一些生理和病理進(jìn)程。ADAM17在細(xì)胞膜表面可以通過蛋白水解作用，剪切細(xì)胞膜上的ACE2，使得ACE2胞外部分脫落，進(jìn)入細(xì)胞外液，降低細(xì)胞膜上ACE2的活性功能，導(dǎo)致細(xì)胞外液的可溶性ACE2片段增多。在一型糖尿病秋田(Akita)小鼠腎小管中，ADAM17表達(dá)增加，它通過剪切細(xì)胞膜上ACE2使得尿液中的游離ACE2片段(70KDa)增加，給予胰島素可逆轉(zhuǎn)這一狀況。有研究證實AngⅡ

7、灌注下，心臟ADAM17活性增加，ACE2表達(dá)減少且活性下降，最終引起心臟肥大和纖維化。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3，TIMP3)是ADAM17的內(nèi)源性抑制劑，它可以抑制了ADAM17介導(dǎo)的底物胞外域脫落。有研究報道，AngⅡ誘導(dǎo)可以增加心肌TIMP3表達(dá)增加，而AngⅡ的灌流兩周不能使TIMP3-/-小鼠的心臟肥大，可見TIMP3參與AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大的

8、病理過程。研究證實中樞腦組織中存在ADAM17的表達(dá)，其是杏參與中樞特別是交感中樞RVLM內(nèi)ACE2的調(diào)節(jié)，仍不清楚。有研究報道，白藜蘆醇(resveratrol，RSV)在外周可以增加TIMP3表達(dá)，而果糖誘導(dǎo)的高血壓大鼠口服RSV的1周后血壓下降，那么RSV是否通過TIMP3/ADAM17作用，增加了中樞內(nèi)ACE2的功能從而參與血壓的調(diào)控呢，仍不清楚。
　　RSV是一類多酚類化合物，具有多種的心血管調(diào)節(jié)保護(hù)功能。RSV在很多病

9、理和生理條件下可以增加ACE2的表達(dá)和活性，改善疾病狀態(tài)。如RSV通過上調(diào)腹主動脈和腎上主動脈的ACE2的表達(dá)和活性來抑制ApoE-/-小鼠腹主動脈瘤的生長。此外，攝入RSV可以增加高脂飲食小鼠脂肪組織中ACE2的表達(dá)，而降低ACE的表達(dá)。此前，本課題組發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠中樞第四腦室灌流RSV產(chǎn)生抗高血壓效應(yīng)，且高血壓大鼠RVLM內(nèi)ACE2的變化直接影響血壓和交感輸出，而ACE2的活性受到ADAM17的調(diào)控，同時ACE2和ADAM17也受到

10、AngⅡ的調(diào)節(jié)，那么RSV在中樞的抗高血壓效應(yīng)是否通過ADAM17蛋白介導(dǎo)調(diào)節(jié)RVLM內(nèi)的ACE2活性來參與的呢？中樞RVLM內(nèi)RAS系統(tǒng)異常是否通過ADAM17介導(dǎo)調(diào)節(jié)ACE2的活性并參與高血壓的形成呢？
　　因此，根據(jù)以上背景確立本課題的研究目標(biāo)是(1)高血壓大鼠中樞ACE2活性下降是否與TIMP3/ADAM17的異常相關(guān)，正常血壓大鼠WKY中樞灌流AngⅡ能否在RVLM內(nèi)通過TIMP3/ADAM17來降低ACE2活性;(2)

11、RSV在交感中樞RVLM是能否來調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá)和活性，能否對TIMP3/ADAM17通路產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用;(3)在PC-12細(xì)胞中干擾TIMP3的表達(dá)，能否拮抗RSV對ADAM17和ACE2調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　實驗動物為雄性正常血壓Wistar Kyoto(WKY)大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat，SHR)，動物體重在250-330g之間，細(xì)胞模型為PC-12細(xì)胞系

12、。通過第四腦室灌流RSV對大鼠中樞施行持續(xù)定量給藥，使用無創(chuàng)尾動脈法動態(tài)監(jiān)測實驗大鼠血壓，使用腦定位微透析法對RVLM的細(xì)胞外液進(jìn)行收集，采用WKY第四腦室灌流AngⅡ來確定其對RVLM內(nèi)ADAM17和ACE2的影響，使用免疫熒光共聚焦法檢測RVLM神經(jīng)元ADAM17的表達(dá)，使用淬滅熒光底物檢測腦組織及腦脊液中的ACE2活性。
　　結(jié)果:
　　一、高血壓大鼠RVLM前交感神經(jīng)元ADAM17表達(dá)增加
　　免疫熒光檢測顯示

13、大鼠RVLM前交感神經(jīng)元存在ADAM17的表達(dá);通過Western Blot檢測大鼠ADAM17蛋白表達(dá)顯示:SHR組的RVLM內(nèi)ADAM17表達(dá)顯著高于對照組WKY組(P＜0.05，n=5)。
　　二、AngⅡ通過TIMP3/ADAM17途徑下調(diào)RVLM內(nèi)ACE2的功能
　　（一）AngⅡ減弱RVLM細(xì)胞上ACE2功能而增強RVLM細(xì)胞外液ACE2活性。WKY第四腦室分別灌流人工腦脊液（artificial cerebro

14、spinal fluid,aCSF）和AngⅡ一周。相比灌流aCSF，灌流AngⅡ一周后平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)和心率(heart rate，HR)顯著增高[MAP:113±4vs.151±4mmHg;HR:360±5vs.395±6beats/min(BPM)，P＜0.05，n=5]，使用試劑盒檢測實驗標(biāo)本ACE2活性發(fā)現(xiàn):灌流AngⅡ的WKY組(WKY+AngⅡ)RVLM組織內(nèi)ACE2活性低

15、于對照組(WKY+aCSF)的活性(454±44.7vs.180±73.2AFU/μg/min,P＜0.05，n=5)，而RVLM的細(xì)胞外液（腦脊液）ACE2活性顯著高于對照組（1370+470vs.0AFU/ml/min，P＜0.05，n=5）。
　?。ǘ〢ngⅡ減少RVLM組織內(nèi)TIMP3表達(dá)并增加ADAM17表達(dá)。Western Blot檢測顯示:灌流AngⅡ的WKY-RVLM內(nèi)ADAM17表達(dá)水平高于對照組(WKY+aC

16、SF)，而TIMP3的表達(dá)水平則低于對照組。
　　三、中樞白藜蘆醇(RSV)通過TIMP3/ADAM17通路上調(diào)高血壓大鼠RVLM內(nèi)ACE2功能
　　第四腦室灌流實驗分成四組WKY+aCSF、WKY+RSV、SHR+aCSF和SHR+RSV。
　?。ㄒ唬┲袠蠷SV降低高血壓大鼠的血壓。SHR第四腦室灌流RSV(SHR+RSV)后，第5天血壓開始下降，約在第7天下降至最低值后趨于平緩穩(wěn)定，與對照組SHR+aCSF相比，S

17、HR+RSV組血壓顯著下降（161±2vs.143±2mmHg，P＜0.05，n=5）。而WKY的血壓與灌藥前相比無明顯變化(P＞0.05，n=5)。
　　（二）RSV增加高血壓大鼠RVLM組織ACE2活性，并減少RVLM細(xì)胞外液ACE2活性。使用試劑盒分別檢測腦組織和透析液中的ACE2活性顯示:SHR+aCSF組RVLM內(nèi)細(xì)胞外液（腦脊液）的ACE2活性顯著高于WKY+aCSF(1455+287vs.0AFU/ml/min，P＜

18、0.05，n=8)而RVLM組織內(nèi)的活性則顯著低于WKY+aCSF組(291±13.2vs.464.0±48.5AFU/μg/min，P＜0.05，n=8)。
　　結(jié)論:
　　高血壓大鼠RVLM內(nèi)ACE2表達(dá)與活性的下降與增多的中樞AngⅡ誘導(dǎo)的ADAM17功能增強相關(guān)，而中樞RSV通過TIMP3/ADAM17增加SHR-RVLM內(nèi)ACE2的表達(dá)和活性，改善心血管功能，本研究揭示高血壓中樞ACE2調(diào)節(jié)的新機理，為高血壓的防治