pH-響應(yīng)納米藥物載體的設(shè)計(jì)與合成.pdf

1、pH-響應(yīng)性聚合物是一種能夠隨環(huán)境pH變化而產(chǎn)生物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)的智能聚合物。結(jié)合最新的納米技術(shù)，pH-響應(yīng)聚合物已被廣泛用于納米藥物載體的設(shè)計(jì)。利用正常組織和血液(pH7.4)、腫瘤細(xì)胞外環(huán)境(pH6.8)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境(pH4.5-6.5)之間的pH差異，pH-響應(yīng)性藥物載體可以在特定部位釋放抗癌藥物或基因藥物，以提高治療效果和降低毒副作用。
　　本論文基于pH-響應(yīng)性聚合物聚(β-氨基酯)(PBAE)、聚（二硫胺）(PS

2、SA)、聚乙烯亞胺(PEI)，構(gòu)建了四種載體，運(yùn)送抗癌藥物或基因藥物:該載體含有對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)還原環(huán)境敏感的二硫鍵或?qū)?xì)胞內(nèi)涵體/溶酶體的低pH值具有響應(yīng)性的化學(xué)鍵（酯鍵、氨基甲酸酯鍵等），確保聚合物材料在響應(yīng)特殊環(huán)境時(shí)發(fā)生降解，有良好的生物相容性;可質(zhì)子化的伯氨基、仲胺基或叔氨基則在腫瘤細(xì)胞外酸性環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)涵體/溶酶體的更低pH酸性環(huán)境，快速質(zhì)子化，改變載體性能（親水性、正電荷等），釋放負(fù)載基因或藥物。
　　(1)自組裝制備靶

3、向肝癌的聚合物膠束藥物載體
　　針對(duì)聚合物膠束藥物載體存在過(guò)早釋放藥物和缺少有效進(jìn)入腫瘤機(jī)制的問(wèn)題，利用非共價(jià)鍵作用力自組裝制備了靶向肝臟的聚合物膠束納米載體。合成了一系列含有高度疏水烷基碳鏈的聚乙二醇-co-聚（β-氨基酯）(MPEG-PBAE)，能夠在水中自組裝形成負(fù)載阿霉素(DOX)的聚合物膠束。在高度稀釋的情況下聚合物膠束仍能夠保持穩(wěn)定性，并響應(yīng)pH4.5的溶液環(huán)境快速釋放出DOX，沒(méi)有觀察到突釋現(xiàn)象。然后設(shè)計(jì)合成了兩親性

4、的十二烷基-乳糖靶向配體(Gal-C12)，通過(guò)疏水相互作用協(xié)同自組裝Gal-C12、MPEG-PBAE和DOX，制備負(fù)載DOX、表面修飾半乳糖殘基的聚合物膠束。細(xì)胞內(nèi)吞、體外細(xì)胞毒性和細(xì)胞周期分析等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)無(wú)唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞路徑，半乳糖官能團(tuán)化的聚合物膠束能夠高效運(yùn)送DOX進(jìn)入HepG2細(xì)胞（肝癌細(xì)胞），在細(xì)胞內(nèi)釋放出負(fù)載DOX，顯著提高DOX的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。該靶向肝臟藥物運(yùn)送平臺(tái)具有方便靶向修飾、顯著提高藥

5、物療效等優(yōu)點(diǎn)，非常有希望用于癌癥治療。
　　(2)PEI-g-PSSA-g-PEI聚合物囊泡用作基因運(yùn)送載體
　　聚合物囊泡和脂質(zhì)體都有相似的中空囊泡結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體是研究最多的非病毒基因載體之一，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000已經(jīng)商品化。而聚合物囊泡用作基因載體的報(bào)道較少，應(yīng)用前景非常廣闊?，F(xiàn)有的聚合物囊泡所帶的正電荷密度非常低，不適合作基因載體。設(shè)計(jì)合成了一系列的陽(yáng)離子兩親性聚合物PEI-g-PSSA-g-

6、PEI，在水溶液中自組裝成陽(yáng)離子聚合物囊泡。為了探討聚合物疏水性對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響，PEI-g-PSSA-g-PEI在統(tǒng)一的聚合反應(yīng)條件下合成，選用相同分子量的PEI片段作陽(yáng)離子聚合物組分，通過(guò)改變PSSA主鏈?zhǔn)杷M分含量和使用不同疏水碳鏈長(zhǎng)度的胺單體調(diào)控PEI-g-PSSA-g-PEI的疏水性。聚合物疏水組分含量分別為100％、80％、70％、60％，疏水胺單體分別有十二胺、十四胺、十六胺。聚合物疏水性與DNA親和力有關(guān)。基于PEI-g

7、-PSSA-g-PEI的聚合物囊泡能自動(dòng)包裹DNA形成復(fù)合物，平均粒徑小于200 nm，zeta電位為+10-+35 mV。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩親性聚合物疏水/親水平衡是轉(zhuǎn)染效率的重要影響因素。對(duì)COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染最高的是Ⅱ-70％，疏水胺單體為十四胺，疏水組分含量為70％。與PEI25k和Lipofectamine2000相比，Ⅱ-70％的轉(zhuǎn)染效率顯著提高，細(xì)胞毒性則明顯降低。研究結(jié)果表明具有可調(diào)控疏水性的陽(yáng)離子聚合物囊泡是非常

8、有潛力的非病毒基因載體。
　　(3)硫特異性降解的聚乙烯亞胺類(lèi)基因運(yùn)送載體
　　含有二硫鍵的交聯(lián)PEI衍生物是一類(lèi)非常重要的陽(yáng)離子聚合物基因載體，在血液和細(xì)胞外保持穩(wěn)定，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)還原性環(huán)境后快速降解，能夠顯著提高轉(zhuǎn)染效率并降低聚合物的細(xì)胞毒性。文獻(xiàn)報(bào)道的含有二硫鍵的交聯(lián)PEI，在細(xì)胞內(nèi)還原性環(huán)境降解產(chǎn)生游離巰基，容易與細(xì)胞固有的巰基形成新的二硫鍵或破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵，擾亂細(xì)胞正常過(guò)程。為了解決這一問(wèn)題，用二硫碳酸酯連接結(jié)

9、構(gòu)(-NH-CO-O-CH2CH2SS-)將低分子量PEI(Mw∶2kDa)拼接成高分子量的PEI衍生物(PEI-SS-CL)。ESI-MS質(zhì)譜證實(shí)二硫碳酸酯連接結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)還原性環(huán)境中首先發(fā)生二硫鍵斷裂，然后巰基進(jìn)攻相鄰的氨基甲酸酯連接鍵，將巰基轉(zhuǎn)化為五元環(huán)小分子化合物1，3-氧硫-2-環(huán)戊酮。PEI-SS-CL-1.5（交聯(lián)劑、PEI2k摩爾比為1.5∶1）能夠轉(zhuǎn)染COS-7、HepG2、Raw246.7等多種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率明顯高于

10、商品化轉(zhuǎn)染試劑PEI25k和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，細(xì)胞毒性則顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在交聯(lián)PEI中引入硫特異性降解機(jī)制是設(shè)計(jì)安全、高效基因載體的有效策略。
　　(4)異雙官能團(tuán)交聯(lián)的PEI類(lèi)基因運(yùn)送載體
　　為了開(kāi)發(fā)出安全、高效的基因載體，研究者們通常使用同雙官能團(tuán)交聯(lián)劑拼接低分子量PEI，得到可生物降解的高分子量PEI衍生物。由于反應(yīng)活性官能團(tuán)沒(méi)有差異，極易暴聚得到不溶于水的高分子量聚合物。設(shè)計(jì)合

11、成了含有氯甲酸酯和丙烯酸酯反應(yīng)活性基團(tuán)的異雙官能交聯(lián)劑。由于氯甲酸酯與PEI的氨基反應(yīng)活性高于丙烯酸酯，PEI的氨基在-10℃優(yōu)先與氯甲酸酯反應(yīng)，使得交聯(lián)劑一端偶聯(lián)到PEI上，當(dāng)反應(yīng)溫度升至室溫后，丙烯酸酯與PEI的氨基進(jìn)一步發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，完成交聯(lián)反應(yīng)。因此，應(yīng)用該可控交聯(lián)策略有希望得到適當(dāng)分子量、分子量分布窄的PEI衍生物。合成的交聯(lián)PEI分子量為原料PEI2k的30-90倍，溶解度大于1 mg/mL。異官能團(tuán)交聯(lián)PEI衍生物能

12、高效包裹DNA形成復(fù)合物，平均粒徑100-200 nm，zeta電位+20-+35 mV。合成交聯(lián)PEI中，轉(zhuǎn)染效率最高的是PEI-HCL-1.5，交聯(lián)劑為含有氯甲酸酯、丙烯酸酯的1，4-丁二醇衍生物，交聯(lián)劑、PEI摩爾比為1.5∶1。與PEI25k和商品化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000相比，PEI-HCL-1.5的轉(zhuǎn)染效率顯著提高，細(xì)胞毒性較低。以上結(jié)果表明，使用異雙能團(tuán)交聯(lián)劑交聯(lián)低分子量PEI，反應(yīng)易于控制，可以得