單寧酶產(chǎn)生菌的篩選及其固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的研究.pdf

1、單寧酶(Tannase EC3.1.1.20)，全稱單寧?；饷福═annins acyl hydrolase），是一種能水解沒食子酸單寧分子中的酯鍵和縮酚酸鍵的水解酶。目前，單寧酶已被廣泛應(yīng)用于飲料、食品、制革、化妝品及化工制藥等行業(yè)中。單寧酶的主要來源是微生物，但菌種產(chǎn)酶量及酶活力偏低，嚴(yán)重制約單寧酶的進(jìn)一步應(yīng)用。因此開展產(chǎn)單寧酶菌株的選育及發(fā)酵研究具有重要的實(shí)際意義。
　　本研究首先從產(chǎn)單寧酶菌種的篩選開始，采用柿渣富集培

2、養(yǎng)基和含單寧酸2.0％的溴酚蘭篩選培養(yǎng)基，從柿子果園土壤中篩選獲得一株產(chǎn)單寧酶的菌種NHF5，通過菌落形態(tài)和孢子特點(diǎn)及分子生物學(xué)技術(shù)，最終鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger)命名Asp.niger NHF5。
　　通過對(duì)Asp.niger NHF5液體發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物、碳源和氮源種類研究，發(fā)現(xiàn)適用于NHF5液體發(fā)酵的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物、碳源和氮源分別為單寧酸、葡萄糖和硫酸銨;應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物、碳源和氮

3、源種類的添加量最終確定液體最佳發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(L):單寧酸22 g、葡萄糖17g、硫酸銨13 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g。液體培養(yǎng)優(yōu)化后，Asp.nigerNHF5產(chǎn)單寧酶活力提高約4.5倍。
　　通過對(duì)培養(yǎng)溫度、接種量、溶液pH值等發(fā)酵條件的研究，最終確定液體發(fā)酵NHF5產(chǎn)單寧酶的最適培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度28℃、接種量為5％、培養(yǎng)基最適pH為6、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為160 r/min，2

4、50 mL三危瓶中裝液量為60 mL，培養(yǎng)72小時(shí)。液體培養(yǎng)條件優(yōu)化后，Asp.niger NHF5產(chǎn)單寧酶活力提高約6.3倍。
　　通過對(duì)NHF5固體發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物、碳源和氮源種類對(duì)產(chǎn)單寧酶活力的影響研究，最終確定柿渣、麥麩和豆粕為最佳添加物;同時(shí)經(jīng)響應(yīng)面分析，最終確定固體最佳發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基（5 g基質(zhì)）含:柿子渣0.2 g(4.0％)、麥麩2.88 g(57.6％)和豆粕1.92 g(38.4％)，4mL含有氯化銨11.0

5、％、七水合硫酸鎂1.0％和氯化鈉0.1％的無機(jī)鹽溶液。固體培養(yǎng)優(yōu)化后，Asp.niger NHF5產(chǎn)單寧酶活力提高約3.98倍。
　　通過優(yōu)化固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶培養(yǎng)基的初始含水量、最適溫度等因素，確定固體發(fā)酵Asp.niger NHF5產(chǎn)單寧酶的最適培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基初始含水量為80％、溫度為30℃、接種量為9％、培養(yǎng)72小時(shí)。固體培養(yǎng)優(yōu)化后，Asp.niger NHF5產(chǎn)單寧酶活力提高約5.5倍。
　　通過對(duì)Asp.nige

6、r NHF5的固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的酶學(xué)性質(zhì)的比較分析，發(fā)現(xiàn):Asp.niger NHF5在液體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的酶促反應(yīng)最適pH值為5，最適溫度為50℃，而固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的酶促反應(yīng)最適pH值為6，最適溫度為55℃，并且酶的溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性優(yōu)于液體發(fā)酵所產(chǎn)單寧酶。Asp.niger NHF5在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中所產(chǎn)單寧酶在降解柿中單寧及提高柿子出汁率效果明顯。
　　本研究從柿園土壤中篩選獲得了一株產(chǎn)單寧酶的黑曲霉菌株Asp.n