IL-21在核苷（酸）類藥物治療慢性乙型肝炎患者停藥后的表達與臨床意義.pdf

1、背景與目的：
　　核苷類藥物(nucleos(t)ide analogues，NAs)是目前治療CHB的常用藥物之一。由于NAs在治療CHB患者過程中，其應答率較高，每日僅需口服一次且副作用小，因此在臨床上被廣泛使用。但又因其治療CHB療程的長期性與不確定性，臨床上患者自行停藥、不規(guī)范停藥的現(xiàn)象較為常見。CHB患者的不規(guī)范停藥與自行停藥會引起一系列不良的嚴重后果，包括病毒反彈、促進耐藥與病情的進一步進展，造成后續(xù)治療困難。NAs抗

2、HBV治療停藥后的持久應答是我們期望的滿意治療終點。所謂持久應答，是指停藥后至少一年，仍能保持治療結(jié)束時的完全應答，即血清轉(zhuǎn)氨酶復常、血清HBV DNA陰性且維持HBeAg血清學轉(zhuǎn)換。
　　近年來有不少回顧性研究預測停藥后持久應答，但主要集中在臨床指標的分析上，包括患者年齡、血清HBsAg水平、HBeAg血清轉(zhuǎn)換時HBV DNA水平、cccDNA水平、乙型肝炎病毒核心抗原相關抗原(HBcrAg)水平、口服NAs患者獲得應答的時間和

3、NAs鞏固治療時間等，較為一致的結(jié)論是:患者年齡越小、停藥時血清HBsAg水平越低、HBeAg血清轉(zhuǎn)換時HBV DNA水平越低、肝組織中cccDNA水平越低、血清HBcrAg水平越低、NAs治療中獲得完全應答時間越短、取得完全應答后NAs鞏固治療時間越長，停藥后復發(fā)的機會越少。
　　然而，隱藏在這些臨床常規(guī)指標后面的免疫學參數(shù)、以及其免疫控制持久應答的機制，尚待深入研究。白細胞介素-21（IL-21）是一種主要由活化的CD4+T細

4、胞、NKT細胞和Th17細胞產(chǎn)生的多功能細胞因子。IL-21與IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15一樣擁有相同的細胞因子受體γ鏈即γc。它的多效性表現(xiàn)在:調(diào)控免疫球蛋白的生成，引導終末期B細胞分化成漿細胞，協(xié)同地擴展CD8+T細胞的增殖，引導Th17的分化，對樹突狀細胞的抗原提呈有抑制作用，可以促進B細胞和NK細胞凋亡。此外，IL-21具有抗腫瘤效應的可能，與病毒感染性疾病的發(fā)展相關。因此在體內(nèi)調(diào)控IL-21的活動對于一部

5、分疾病具有臨床應用的潛力。
　　本研究通過隨訪并檢測經(jīng)NAs治療停藥后的CHB患者血清病毒學及生化學指標，探討預測停藥后持久應答的臨床指標;通過檢測停藥患者血清IL-21的水平，探討IL-21與停藥后持久應答的相關性;通過檢測停藥患者機體HBV-特異性CD8+T細胞功能，分析血清IL-21水平與CD8+T細胞應答的關系，探討停藥患者維持持久應答的可能機制，為拓展IL-21和相關免疫細胞在慢性HBV感染者中的臨床應用提供科學依據(jù)。<

6、br>　　方法：
　　1.停藥后臨床指標的檢測
　　對于治療前HBeAg陽性停藥患者，持續(xù)口服NAs治療至HBV DNA在檢測線以下、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)復常、HBeAg發(fā)生血清轉(zhuǎn)換后再繼續(xù)鞏固治療至少12個月;對于治療前HBeAg陰性患者，治療至HBV DNA在檢測線以下、ALT復常后再繼續(xù)鞏固治療至少18個月。所有病例均排除甲、丙、丁、戊型肝炎及其他病毒感染及自身免疫性肝病、肝硬化、肝細胞癌等。篩選合格患者按停藥標準停藥

7、，停藥后納入我們的密切跟蹤隨訪系統(tǒng)。所有受試者各隨訪點采清晨空腹靜脈血30ml:其中抗凝血20ml，采用密度梯度離心法分離外周血單個核淋巴細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，-80℃保存;促凝血10ml，離心后取上清置PC管中-20℃保存，同批檢測。
　　本項研究已經(jīng)在世界衛(wèi)生組織國際臨床試驗注冊平臺注冊(注冊號:ChiCTR-ONRC-12002315)。經(jīng)南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院倫

8、理委員會審批，本臨床研究已經(jīng)通過并批準進行(NFEC-201209-K3)。本研究每位入選患者都給予充分知情同意并書面簽署知情同意書。
　　臨床指標的實驗室檢測:生化學檢測:采用Olympus AU5400全自動生化分析儀。病毒學檢測:HBV DNA定量檢測采用Combas熒光定量PCR法分析，采用微粒子化學發(fā)光法檢測HBV血清標志物（HBsAg、 HBsAb、HBeAg、 HBeAb和HBcAb）。
　　2.血清IL-21

9、水平的檢測
　　采用雙抗體夾心ELISA(eBioscience，San Jose，CA，USA)方法檢測受試者血清IL-21水平。嚴格按照試劑盒說明書進行，取受試者血清及標準品各100ul加入酶標板，其中標準品做倍比稀釋。終止反應后，采用酶標儀(FACSCalibur，BD，USA)測定吸光度(OD)值，以OD值計算IL-21水平。
　　3.HBV-特異性T細胞應答的檢測
　　復蘇凍存的PBMC，分為HBV核心肽庫刺

10、激孔與再刺激孔進行鋪板，第四天加入IL-2，刺激十天后，采用細胞內(nèi)細胞因子染色(Intracellular cytokinestaining，ICS)檢測，檢測前加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(Brefeldin A，BFA)孵育5小時。表面標記抗體:7AAD-Percp，anti-CD3-FITC，anti-CD8-APC，胞內(nèi)標記抗體:anti-IFN-γ-PE，洗滌后加300ul2％多聚甲醛固定，上機檢測。結(jié)果計算:以再刺激孔IFN-γ+CD

11、8+T細胞頻數(shù)減去未再刺激孔 IFN-γ+CD8+T細胞頻數(shù)大于0為HBV-特異性CD8+T細胞陽性。
　　結(jié)果：
　　1.CHB患者經(jīng)NAs治療停藥后臨床指標對持久應答的預測作用
　　60例符合停藥標準的CHB患者停藥，經(jīng)51.3±1.9(48-56)周的隨訪，病毒學復發(fā)患者24例(40％)，其中臨床復發(fā)13例(21.6％)（6例復發(fā)點為停藥后第12周;7例復發(fā)點為停藥后第24周），對于臨床復發(fā)患者再次予核苷類藥物抗

12、病毒治療，同時本停藥研究的隨訪結(jié)束，納入普通隨訪;持續(xù)應答患者36例。持續(xù)應答組患者在停藥基線年齡及HBsAg滴度顯著低于病毒學復發(fā)組(p=0.03，p=0.001)，但在性別比例、治療前HBeAg狀態(tài)、總治療時間、應答時間以及鞏固治療時間上均無顯著差異。
　　2.停藥患者血清IL-21水平的動態(tài)變化
　　60例CHB患者停藥基線、停藥后第12周、第24周、第48周血清IL-21水平依次為40.90pg/ml(24.50-1

13、82.44pg/ml)、42.71p g/mi(24.50-156.16.17pg/ml)、42.68pg/ml(25.92-215.48pg/ml)、42.90pg/ml(27.35-200.85pg/ml)，停藥后第12周、第24周、第48周與停藥基線相比均無顯著性差異;病毒學復發(fā)組停藥基線、停藥后第12周、第24周、第48周血清IL-21水平依次為42.68pg/ml(25.92-182.44pg/ml)、41.48pg/ml(2

14、4.50-150.16pg/ml)、45.68pg/ml(28.77-215.48pg/ml)、42.64pg/ml(27.35-200.85pg/ml)，其中停藥后第12周、第24周、第48周與停藥基線相比均無顯著性差異。持續(xù)應答組停藥基線、停藥后第12周、第24周，第48周血清IL-21水平依次為39.59pg/ml(24.50-117.16pg/ml)、42.71pg/ml(25.92-114.53pg/ml)、40.84pg/m

15、l(25.92-118.48pg/ml)、43.52pg/ml（28.77-128.65pg/ml），其中停藥后第12周、第24周、第48周顯著高于停藥基線（分別p=0.0035，p=0.0124，p=0.0002）。
　　3.血清IL-21水平與血清HBsAg滴度及HBV DNA水平的關系
　　病毒學復發(fā)組血清HBV DNA水平隨著隨訪時間延長呈持續(xù)上升趨勢，血清HBsAg滴度無明顯變化，血清IL-21水平亦無明顯變化。而

16、在持續(xù)應答組血清HBV DNA水平隨著隨訪時間延長，呈持續(xù)穩(wěn)定低水平，血清HBsAg滴度亦無明顯變化，但血清IL-21水平在隨訪過程中呈穩(wěn)定高水平狀態(tài)。60例停藥患者總血清IL-21水平與血清HBsAg滴度及HBV DNA水平間均無顯著相關性;病毒學復發(fā)組及持續(xù)應答組血清IL-21水平與血清HBV DNA水平無顯著相關性;病毒學復發(fā)組血清IL-21水平與血清HBsAg滴度呈正相關(r=0.290，p=0.01)，持續(xù)應答組血清IL-21

17、水平與血清HBsAg滴度呈負相關(r=-0.328，p＜0.0001)。
　　4.HBV-特異性T細胞應答
　　我們對20例HLA-A2陽性患者停藥基線HBV-特異性T細胞應答進行檢測，HBV-特異性T細胞應答檢出率為30％(6/20)，而IFN-γ+CD8+T細胞百分比為0.133％±0.062％（0.054％-0.228％），HBV-特異性T細胞應答在病毒學復發(fā)組與持續(xù)應答組患者分別檢出2例(2/11)和4例(4/9)，