Thermobifida fusca和Saccharomonospora viridis麥芽糖α-淀粉酶的定點(diǎn)突變.pdf

1、麥芽糖α-淀粉酶是指一類能夠單獨(dú)水解淀粉獲得麥芽糖含量在50％以上糖漿的α-淀粉酶，如與脫支酶配合使用水解淀粉能獲得麥芽糖含量達(dá)70％以上，因而高產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶在工業(yè)生產(chǎn)麥芽糖漿中有重要的應(yīng)用前景。
　　本研究采用定點(diǎn)突變的方法分別對來自Thermobifida fusca和Saccharomonospora viridis的麥芽糖α-淀粉酶(Tfa和Sva)進(jìn)行分子改造，使其酶學(xué)性質(zhì)改善特別是增加水解淀粉的麥芽糖產(chǎn)量以適應(yīng)工

2、業(yè)生產(chǎn)上對高產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶的需求。通過同源建模，選定Tfa的D-219、K-222、H-223、和Y-247這四個關(guān)鍵活性位點(diǎn)定點(diǎn)突變，其中Lys-222與His-223位于底物結(jié)合裂縫催化亞位點(diǎn)+2;選定Sva的His-220進(jìn)行突變研究，其位于底物結(jié)合裂縫催化亞位點(diǎn)+2。
　　Tfa的7個突變子中，除D219A沒有活性以外，其余突變子均有活力。野生酶Tfa的最適溫度為60℃，而六個突變子的最適溫度有著5至15℃不同程度的下

3、降。而在最適pH方面，Tfa和K222R的最適pH為7.5;其余突變子的最適pH有著5至10個單位的下降。H223Q的比活力是唯一比Tfa高的突變子，升高了3.8％，其余突變子均下降超過40％以上，同時所有突變子的Vmax值皆比Tfa要降低。在Km值方面，H223L和H223D比Tfa的Km值降低了20％以上;K222R幾乎沒變，Y247A、H223Q、K222T和Y247A均升高34％以上。在產(chǎn)物生成方面，所有酶的麥芽三糖的含量皆提高

4、，所有突變子的麥芽糖含量都低于Tfa。
　　Sva的突變子H220Q的最適pH與Sva一致都是7.0，但H220Q的最適溫度45℃比Sva降低了10℃。H222Q的Km值比Sva升高了16％，比活力增長了17％，Vmax相差不大。Sva的水解淀粉麥芽糖產(chǎn)量高達(dá)76％，而H223Q的麥芽糖含量比Sva低12％，麥芽三糖則是Sva的1.8倍。反應(yīng)相同時長的麥芽糊精有比淀粉水解更徹底的趨勢。用750U的糖化酶、Sva和H220Q分別與9