熒光探針分子TNP-AMP識別藍藻FBPase抑制劑作用位點的研究.pdf

1、藍藻水華在中國分布廣，對水生態(tài)系統(tǒng)、人體健康以及旅游經(jīng)濟均會造成嚴重危害。尋找高專一性、高效率又環(huán)境友好的殺藻劑，已經(jīng)成為治理藍藻水華的重要需求。研發(fā)有針對性、高專一性的抑制劑，不僅需要選擇適宜的作用靶標，還需研究抑制劑與靶標的結(jié)合模式。
　　藍藻果糖-1，6-二磷酸酶（后簡寫為FBPase）在藍藻體內(nèi)含量極少，卻在光合作用的Calvin循環(huán)中起到了至關重要的作用，而且其序列和結(jié)構(gòu)與動植物體內(nèi)所含F(xiàn)BPase存在著較大差異，故可作

2、為殺藻劑的潛在作用靶標。
　　抑制劑與藍藻FBPase有兩種不同的結(jié)合位點:底物位點和變構(gòu)位點。探究抑制劑與藍藻FBPase的結(jié)合位點，是研究其與藍藻FBPase結(jié)合模式的基礎。本文將熒光探針分子TNP-AMP與藍藻FBPase結(jié)合，按照一定組合模式加入FBP、AMP和抑制劑，通過觀察熒光的猝滅現(xiàn)象，建立了用于初步判斷抑制劑結(jié)合位點的方法。
　　本文主要進行了以下幾方面工作:
　　1.以pET-28a(+)為表達載體、

3、以大腸桿菌E.Coli BL21(DE3)為表達菌株，對藍藻FBPase進行了異源表達，并利用親和層析方法對所得目的蛋白進行純化，最終通過SDS-PAGE電泳驗證其純度，其產(chǎn)量為18.6 mg/L(培養(yǎng)基)。
　　2.探索不同條件對熒光探針分子TNP-AMP結(jié)合藍藻FBPase體系的熒光強度的影響，最終建立了TNP-AMP結(jié)合藍藻FBPase熒光測定體系，具體條件為溫度T=30℃，酸堿性pH=8.0，熒光探針分子TNP-AMP終濃

4、度為12.9μM，藍藻FBPase最適終濃度為15μM，金屬離子Mn2+最適終濃度為400μM。
　　3.探究了金屬離子分別對單獨的熒光染料或者藍藻FBPase的熒光強度的影響，最終認為熒光探針分子TNP-AMP結(jié)合藍藻FBPase的體系中加入金屬離子之所以會引起熒光強度的增強，是因為金屬離子能使藍藻FBPase的構(gòu)象發(fā)生一定程度的轉(zhuǎn)變，從而與熒光探針分子TNP-AMP更好的結(jié)合。
　　4.在前述熒光測定體系中，通過加入已知

5、結(jié)合位點為底物位點的FBP和已知結(jié)合位點為變構(gòu)位點的AMP兩種化合物，觀測熒光的猝滅，得出結(jié)論:熒光探針分子TNP-AMP不僅結(jié)合于藍藻FBPase的變構(gòu)位點，也結(jié)合于其底物位點。
　　5.探索有望用于初步判斷藍藻FBPase抑制劑的結(jié)合位點的方法，并利用已知結(jié)合位點為底物位點的F6P化合物對此方法的準確性和可行性進行了驗證。
　　6.依次對hs，hx和x系列化合物以藍藻FBPase為靶標進行初篩，通過分析初篩結(jié)果，選取x系