多拉菌素產(chǎn)生菌株的構(gòu)建及發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、多拉菌素(doramectin)是阿維菌素(avermectin)第三代衍生物，由阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)的α-酮酸脫氫酶(BCDH)阻斷突變株經(jīng)突變生物合成獲得，化學(xué)本質(zhì)為一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。與其它大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不同，其生物學(xué)活性主要表現(xiàn)為高效驅(qū)殺動(dòng)物體內(nèi)外寄生蟲。多拉菌素比其它阿維菌素類藥物具有更高的殺蟲活性和更久的持效時(shí)間，被認(rèn)為是最具有開發(fā)潛力的廣譜抗寄生蟲新藥。
　　本研究通過同

2、源雙交換法成功地對(duì)bkdFGH基因簇進(jìn)行缺失，構(gòu)建獲得了阿維菌素前體合成阻斷突變株LZ-01。該突變株無法合成阿維菌素，在發(fā)酵過程中添加環(huán)己羧酸鈉作為前體，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，獲得未知組分1，其出峰時(shí)間與多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品一致，可初步認(rèn)定為多拉菌素(CHC-B1)。aveD基因編碼的C5-O-甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)了阿維菌素“B”組分向“A”組分的轉(zhuǎn)化。本研究通過同源雙交換法，以突變株LZ-01做為出發(fā)菌株，對(duì)aveD進(jìn)行缺失，構(gòu)建了阿維鏈霉菌

3、aveD基因缺失突變株LZ-02。該突變株在發(fā)酵過程中添加外源前體環(huán)己羧酸鈉，經(jīng)HPLC檢測(cè)仍可合成未知組分1，但已經(jīng)不再產(chǎn)生CHC-A組分。發(fā)酵產(chǎn)物中未知組分1經(jīng)LC/MS檢測(cè)確認(rèn)為多拉菌素。aveC基因是阿維鏈霉菌生物合成基因簇中非常重要的基因，研究表明其參與了多拉菌素“2”組分向“1”組分的轉(zhuǎn)化。本研究通過全基因合成帶有10個(gè)突變位點(diǎn)(包括D48E和E238D)的aveC*基因，以LZ-02做為出發(fā)菌株，構(gòu)建獲得了aveC*基因過

4、表達(dá)突變株LZ-03。該突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中多拉菌素(CHC-B1)與CHC-B2產(chǎn)量比例基本未改變，但兩者的總產(chǎn)量有顯著提高。以突變株LZ-01、LZ-02作為出發(fā)菌株，對(duì)多拉菌素的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:多拉菌素最佳的發(fā)酵時(shí)間為311h(約13d)，發(fā)酵培養(yǎng)基以棉籽粉和豆粕作為復(fù)合氮源最佳。同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的添加進(jìn)行了研究，確定最佳的無機(jī)鹽為ZnSO4。通過對(duì)磷酸鹽濃度的測(cè)試，確定了發(fā)酵培養(yǎng)基KH2PO4的添加濃度為0.5