犢牛腹瀉主要病原菌毒力基因檢測及其重組表達(dá).pdf

1、犢牛腹瀉是影響犢牛早期生長發(fā)育最為嚴(yán)重的疾病。大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起犢牛腹瀉的主要病原菌，快速檢測這三種病原菌并調(diào)查其流行的毒力基因尤為必要。本研究針對上述病原細(xì)菌建立三套多重PCR檢測體系，檢測了犢牛臨床腹瀉樣品，并采用直接分離和生物過濾分離方法分離出毒力菌株。重點(diǎn)研究了產(chǎn)毒性大腸桿菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)主要毒力因子耐熱腸毒素(Heat-stable toxin，ST)和不耐熱腸毒

2、素(Heat-labile toxin，LT)的基因克隆、表達(dá)，通過免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了重組抗原具有良好的抗原性。
　　 犢牛腹瀉主要病原菌多重PCR檢測方法的建立。為迅速檢測犢牛腹瀉的主要病原菌和分析其流行的毒力基因，建立了三套多重PCR檢測體系：stx2-k99-f41-stx1、st-invA-eae-lt和cpb-plc-etx。
　　 stx2-k99-f41-stx1檢測體系：實(shí)驗(yàn)選取ETEC的k99、f41基因

3、，產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producing E.coli，STEC)的stx2、stx1基因作為擴(kuò)增靶基因，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了四重PCR檢測體系。對PCR產(chǎn)物回收、測序，驗(yàn)證PCR。多重PCR檢測相關(guān)陽性菌株和陰性菌株的結(jié)果與其已知的基因背景一致。通過平板計(jì)數(shù)確定多重PCR對C83922、EDL933及其混合菌液能夠檢出的最小濃度分別為：1×104CFU/ml、5×103CFU/ml、2×104CFU/ml。<

4、br>　　 st-invA-eae-lt檢測體系：實(shí)驗(yàn)選取ETEC的st、lt基因，致病性大腸桿菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)、出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic E.coli，EHEC)的eae基因同源區(qū)序列和沙門氏菌的invA基因作為擴(kuò)增靶基因，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了四重PCR檢測體系。對PCR產(chǎn)物回收、測序，驗(yàn)證PCR。多重PCR檢測相關(guān)陽性菌株和陰性菌株的結(jié)果與其已知的基因背景一

5、致。通過平板計(jì)數(shù)確定多重PCR對C83922、EDL933、都伯林沙門菌、EWD299和它們混合菌液能夠檢出的最小濃度分別為：3×103CFU/ml、5×103CFU/ml、3×103CFU/ml、1×104CFU/ml和2×104CFU/ml。
　　 cpb-plc-etx檢測體系：實(shí)驗(yàn)選取產(chǎn)氣莢膜梭菌的cpb、plc、etx基因?yàn)閿U(kuò)增靶基因，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了三重PCR檢測體系。對PCR產(chǎn)物回收、測序，驗(yàn)證PCR。多重P

6、CR檢測相關(guān)陽性菌株和陰性菌株的結(jié)果與其已知的基因背景一致。通過平板計(jì)數(shù)確定多重PCR對B型產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠檢出的最小濃度為5×103CFU/ml。
　　 本研究表明犢牛腹瀉主要病原菌的多重PCR檢測方法具有快速、特異且敏感的特點(diǎn)，可用于犢牛腹瀉的快速檢測。
　　 臨床樣品的PCR檢測與細(xì)菌分離鑒定。為了調(diào)查犢牛腹瀉的主要病原菌及其流行的毒力基因，利用建立的三套多重PCR體系檢測了59份犢牛腹瀉樣品，結(jié)果顯示病原性大腸桿

7、菌是引發(fā)犢牛腹瀉的主要病原菌。通過直接分離和生物過濾法分離，均能夠從樣品中分離到毒力菌株。在樣品T1、T2、XL1中分離到同時(shí)攜帶stx1和eae的大腸桿菌；在樣品T3中分離到同時(shí)攜帶stx2、stx1、eae的大腸桿菌和攜帶plc的產(chǎn)氣莢膜梭菌；在樣品X1、X5中分離到攜帶lt的大腸桿菌；在樣品X2、W1中分離到攜帶eae的大腸桿菌；在樣品X4中分離到同時(shí)攜帶stx2、eae、stxl、st的大腸桿菌和攜帶plc的產(chǎn)氣莢膜梭菌；在樣品

8、Q3、Q4中分離到攜帶stx2的大腸桿菌。
　　 大腸桿菌腸毒素ST、LIB融合基因的克隆、表達(dá)和免疫原性初步研究。ETEC是引發(fā)犢牛腹瀉常見的主要病原菌，腸毒素ST、LT是其主要的毒力因子。實(shí)驗(yàn)用PCR的方式獲得st和ltB基因序列，再用重疊PCR的方式獲得其融合基因st-ltB，并在兩者之間加入了編碼柔性多肽G-G-G-S-G-G-G-S的Linker序列。將融合基因連接到pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化到DH5α中。再將融合基

9、因從pMD18-T載體上酶切下來，連接到表達(dá)載體pMa1-p2x上，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Tb1中。采用超聲破碎的方法獲得可溶蛋白上清，以Tb1(pMa1-p2x)為陰性對照進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn)，在62KD和83KD中間有一蛋白條帶；用Anti-Cholera Toxins作為一抗血清(LTB與CTB的氨基酸有80％的同源性)，以羊抗兔IgG作二抗，免疫印跡檢驗(yàn)結(jié)果為陽性，從而進(jìn)一步證明了融合蛋白的表達(dá)。通過優(yōu)化表達(dá)條件，最終確定IPTG終

10、濃度為0.41mmol/L、31℃、誘導(dǎo)8h可以獲得最大的表達(dá)量，目的蛋白約占可溶性蛋白總量的13.4％。使用Amylose柱親和層析純化目的蛋白。以純化后的目的蛋白作為抗原腹腔注射小白鼠100μg/只，兩周免疫一次，同時(shí)免疫7組小鼠，分別在一免之后的7d、14d，二免之后的7d、14d，三免之后的7d、14d、21d采血，制備待檢血清。使用Xa因子蛋白酶切割MBP，以回收的ST-LTB多肽作為包被抗原，間接ELISA法測量抗體滴度，最