兩種多溴聯(lián)苯醚對(duì)褶皺臂尾輪蟲生殖與發(fā)育毒性效應(yīng)及其作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers, PBDEs）是一類在海洋環(huán)境中廣泛存在的持久性有機(jī)污染物（persistent organic pollutants, POPs），對(duì)海洋環(huán)境和海洋生物的影響日趨嚴(yán)重。褶皺臂尾輪蟲（Branchionus plicatilis）是一類重要的無脊椎海洋浮游動(dòng)物，在海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起著重要作用，并且是有機(jī)污染物進(jìn)入海洋食物鏈的重要途徑。但目前有關(guān)PB

2、DEs對(duì)褶皺臂尾輪蟲的研究還非常有限。因此，本研究選擇在海洋環(huán)境和海洋生物體內(nèi)廣泛存在的BDE-47（tetrabrominated diphenyl ether-47, BDE-47）和BDE-209（decabrominated diphenyl ether-209, BDE-209）為脅迫因子，首次將具有重要海洋生態(tài)學(xué)意義的褶皺臂尾輪蟲為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從個(gè)體、組織、細(xì)胞、分子等不同生物層次上系統(tǒng)研究PBDEs急性與慢性脅迫對(duì)褶皺臂尾輪

3、蟲的生殖及發(fā)育毒性效應(yīng)，并對(duì)可能的氧化應(yīng)激（oxidative stress）作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。
　　研究的主要方法與結(jié)果如下：
　　1.通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）方法對(duì)實(shí)驗(yàn)體系中BDE-47和BDE-209實(shí)際濃度的檢測(cè)得出 BDE-47和 BDE-209的溶解濃度低于配制濃度，且BDE-209的溶解度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于BDE-47的溶解度。
　　2.通過Log-probit方法分析得出BDE-47對(duì)褶皺臂

4、尾輪蟲24h-EC50值為7.923 mg/L（95％confidence intervals,3.626~13.634 mg/L）；同樣濃度下，BDE-209對(duì)褶皺臂尾輪蟲沒有發(fā)現(xiàn)半數(shù)抑制效應(yīng)。
　　3.0.2 mg/L的BDE-47和BDE-209分別對(duì)褶皺臂尾輪蟲脅迫24小時(shí)后，利用倒置顯微鏡觀察到，兩種同系物均會(huì)導(dǎo)致褶皺臂尾輪蟲卵巢組織形態(tài)萎縮、脂質(zhì)小滴數(shù)量減少，且BDE-47對(duì)卵巢產(chǎn)生的影響更為明顯。
　　4.以第

5、一次產(chǎn)幼時(shí)間、最后一次產(chǎn)幼時(shí)間、產(chǎn)卵數(shù)、產(chǎn)幼數(shù)和產(chǎn)幼率等生理學(xué)指標(biāo)作為褶皺臂尾輪蟲生殖毒性檢測(cè)指標(biāo)在解剖鏡下進(jìn)行觀測(cè)分析。與對(duì)照組相比，BDE-47和BDE-209各濃度組均能顯著提前（P<0.05或 P<0.001）褶皺臂尾輪蟲的第一次產(chǎn)幼時(shí)間；BDE-47和BDE-209（0.1 mg/L,0.2 mg/L）可顯著（P<0.05或 P<0.001）提前褶皺臂尾輪蟲的最后一次產(chǎn)幼時(shí)間；此外，各濃度的BDE-47能極顯著（P<0.001

6、）降低褶皺臂尾輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)與產(chǎn)幼數(shù)；0.1 mg/L,0.2 mg/L的BDE-47能極顯著（P<0.001）降低褶皺臂尾輪蟲的孵化率；但各濃度的BDE-209不但對(duì)這三項(xiàng)指標(biāo)沒有產(chǎn)生抑制效果，反而有微弱的促進(jìn)作用。
　　5.選擇生殖前期、生殖期和生殖后期作為褶皺臂尾輪蟲發(fā)育毒性生理學(xué)檢測(cè)指標(biāo)在解剖鏡下進(jìn)行觀測(cè)分析。與對(duì)照組相比，BDE-47和BDE-209各濃度組均能顯著縮短（P<0.01或 P<0.001）褶皺臂尾輪蟲的生殖前

7、期；BDE-47（0.2 mg/L）和BDE-209（0.1 mg/L,0.2 mg/L）可極顯著（P<0.001）縮短褶皺臂尾輪蟲生殖期；BDE-47（0.1 mg/L,0.2 mg/L）和BDE-209（0.2 mg/L）可顯著（P<0.01或 P<0.001）縮短褶皺臂尾輪蟲的生殖后期。
　　6.通過篩選生殖與發(fā)育相關(guān)生理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行因子分析（Factor Analysis, FA）得出：生殖期和最后一次產(chǎn)幼時(shí)間兩項(xiàng)指標(biāo)較于其

8、他檢測(cè)指標(biāo)對(duì) BDE-47和BDE-209最為敏感；BDE-47與BDE-209獨(dú)立分析結(jié)果顯示，BDE-47對(duì)褶皺臂尾輪蟲的毒性效應(yīng)側(cè)重于對(duì)成體階段的生殖毒性，而 BDE-209對(duì)褶皺臂尾輪蟲的毒性效應(yīng)則傾向于對(duì)幼體階段的發(fā)育毒性。
　　7.活性氧（Reactive oxygen species, ROS）和鈣離子（Calcium ion, Ca2+）分別負(fù)載熒光探針DCFH-DA和Fluo-3/AM后，先通過熒光顯微鏡觀察它們

9、在褶皺臂尾輪蟲體內(nèi)的熒光強(qiáng)度及分布情況，然后使用 Image-Pro Plus軟件選定卵巢部位對(duì)其熒光值進(jìn)行分析計(jì)算。與對(duì)照組相比，BDE-47（0.1 mg/L,0.2 mg/L）和 BDE-209（0.2 mg/L）能顯著升高（P<0.01或 P<0.001）卵巢細(xì)胞內(nèi)ROS的水平以及Ca2+濃度（[Ca2+]）。
　　8.通過實(shí)時(shí)定量PCR（Real-Time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測(cè)與生殖發(fā)育

10、相關(guān)的vasa和 nanos的基因表達(dá)，以及與氧化應(yīng)激系統(tǒng)相關(guān)的sod、cat和cam的基因表達(dá)。與對(duì)照組相比，結(jié)果表明，BDE-47（0.2 mg/L）能顯著（P<0.01）激活sod的基因表達(dá)；BDE-47和 BDE-209（0.2 mg/L）能顯著（P<0.01）激活cam的基因表達(dá)；但BDE-47和BDE-209對(duì)cat基因的表達(dá)水平均沒有產(chǎn)生顯著影響。
　　得出的主要結(jié)論如下：
　　1. GC-MS實(shí)驗(yàn)表明，BDE

11、-47和BDE-209均難溶于水，且BDE-209的溶解度小于BDE-47的溶解度；
　　2.急性毒性實(shí)驗(yàn)表明，BDE-47對(duì)褶皺臂尾輪蟲的急性毒性大于BDE-209；
　　3.基于形態(tài)學(xué)觀察、生理學(xué)指標(biāo)檢測(cè)以及分子水平上對(duì) vasa和 nanos基因表達(dá)的研究，表明褶皺臂尾輪蟲對(duì) BDE-47和 BDE-209脅迫非常敏感，且推斷卵巢組織是 BDE-47和 BDE-209脅迫褶皺臂尾輪蟲的作用靶器官。
　　4.生殖與

12、發(fā)育毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，不論是具有較高毒性的低溴代聯(lián)苯醚BDE-47還是具有較低毒性的高溴代聯(lián)苯醚 BDE-209都會(huì)抑制褶皺臂尾輪蟲的生殖與發(fā)育，在個(gè)體水平以及分子水平均會(huì)產(chǎn)生生殖與發(fā)育毒性效應(yīng)，且 BDE-47較于BDE-209具有更強(qiáng)的生殖毒性與發(fā)育毒性；此外，低濃度的BDE-209還可能具有潛在的外源性雌激素（xenoestrogen）的作用。
　　5. FA研究表明，在生殖與發(fā)育毒性的各項(xiàng)生理學(xué)指標(biāo)中，生殖期和最后一次產(chǎn)幼

13、時(shí)間對(duì)兩種PBDEs的同系物均最為敏感，因此可作為生物標(biāo)志物的候選指標(biāo)。
　　6.氧化應(yīng)激作用機(jī)制的研究表明，BDE-47和 BDE-209能引起褶皺臂尾輪蟲卵巢組織細(xì)胞內(nèi) ROS水平的升高，當(dāng) ROS水平達(dá)到產(chǎn)生氧化脅迫的水平時(shí)，便會(huì)激活抗氧化系統(tǒng)（antioxidant system）中抗氧化酶 sod和 cat的表達(dá)以及影響 Ca2+平衡和 cam的表達(dá)水平，以期通過基于Ca2+信號(hào)通路的氧化應(yīng)激作用機(jī)制的調(diào)控以消除或減弱