微流控芯片與可控適配體技術(shù)用于細胞代謝物分析及其相互作用的研究.pdf

1、代謝在生物系統(tǒng)中起著重要的作用。生命體組成的基本單元是細胞，對細胞代謝產(chǎn)物的分析，可以了解生物系統(tǒng)的生理和病理反應(yīng)機制以及細胞間信息的傳遞，將有助于探索生命活動的規(guī)律，為疾病的診斷與治療提供有力的依據(jù)。由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，腫瘤標志物的含量一般極低，細胞代謝物的分析需要高靈敏度、高選擇性的分析方法。常規(guī)細胞代謝物的分析方法往往具有操作繁瑣、分析時間長、分析效率低以及成本高的缺點，甚至由于靈敏度低而無法進行分析。近年來逐漸發(fā)展起來的微流控芯片

2、技術(shù)由于具有通道體積小，所需樣品量少，高通量分析的特點，在當(dāng)前的細胞研究中占據(jù)重要的地位。為了更好的模擬體內(nèi)微環(huán)境，本文將在微流控芯片上對體內(nèi)微環(huán)境進行模擬并對兩種細胞進行共培養(yǎng)，開展了一系列以細胞為基礎(chǔ)的在芯片上進行的研究。核酸適配體由于其高特異性，高親和力而廣泛應(yīng)用于蛋白、小分子乃至細胞的分析。功能核酸適配體還可以通過滾環(huán)擴增(RCA)、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等手段對目標DNA進行放大，極大的提高了分析的靈敏度。本文將在微流控芯片

3、平臺上利用核酸適配體對與疾病相關(guān)的細胞代謝物以及相應(yīng)的分子機制展開一系列的研究。具體開展了以下四個方面的工作:
　　1、將微流控芯片技術(shù)和適配體的免疫分析技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了人血漿中凝血酶的便攜式檢測。為了提高凝血酶檢測的線性范圍和靈敏度，利用核酸適配體的可控性將G-四鏈體DNAzyme與適配體組裝，并利用滾環(huán)擴增技術(shù)(RCA)和G-四鏈體DNAzyme實現(xiàn)信號的雙放大。同時，利用G-四鏈體DNAzyme在鐵離子的作用下快速催化AB

4、TS-H2O2，增強吸收，改變顏色，實現(xiàn)了人血中凝血酶的可視化分析。最終，將所建立的方法成功用于人血漿和血清中凝血酶的檢測。所建立的方法還可以用于其它腫瘤標志物的檢測，并有望應(yīng)用于臨床樣品中腫瘤標志物的分析，在疾病的診斷中具有潛在的應(yīng)用價值。
　　2、利用核酸適配體對目標標志物進行DNA標記，實現(xiàn)了多種標志物的同時分析。利用核酸適配體的可控性，對VEGF165，PDGF-BB，和凝血酶，分別設(shè)計和組裝三條不同長度的適配體，通過改變

5、它們的帶電量，從而改變標志物與DNA復(fù)合物的遷移速度，使用芯片毛細管電泳進行分離，實現(xiàn)了三種標志物的快速定量分析。由于蛋白質(zhì)的高分子量，每個蛋白質(zhì)的帶電量固定，所以蛋白質(zhì)與配體的遷移速度之差主要由可控配體所攜帶的電子量決定。另外，假設(shè)每一個堿基攜帶一個電子，而互補的堿基則不帶電子，通過設(shè)計不同長度的單鏈DNA，可以得到不同的帶電量，從而可以改變適配體的遷移速度，以及配體與蛋白質(zhì)復(fù)合物在芯片毛細管電泳中的遷移速度。由于細胞代謝物基質(zhì)的復(fù)雜

6、性，會影響三種標志物的分離度。為了提高分離度，減少基質(zhì)的干擾，實現(xiàn)定性定量分析，引入了一條低分子量的DNA和一條非特異性的DNA作為內(nèi)標物并抑制干擾。最終實現(xiàn)了不同細胞中三種代謝物的分析檢測，有望將所建立的方法用于其它小分子代謝物的分析，為疾病的診斷、腫瘤的發(fā)生發(fā)展檢測以及新標志物的發(fā)現(xiàn)和藥物篩選提供新的方法和手段。
　　3、構(gòu)建一個集成化的微流控芯片，用于細胞的共培養(yǎng)、缺？氧誘導(dǎo)以及代謝物VEGF165的在線分析。兩層的微流控芯

7、片用于構(gòu)建氧梯度微環(huán)境和代謝物的在線檢測裝置。細胞培養(yǎng)箱中不同長度的連接通道用于考察距離對細胞間相互作用的影響。分別用5％，15％和20％的氧含量對細胞進行刺激，不僅對細胞的形態(tài)、增殖率和凋亡進行了觀察，還研究了不同氧含量對活性氧、分泌物VEGF165蛋白表達量變化的影響以及已經(jīng)相關(guān)基因（HIF-1α和VEGF165）的研究，深入探索了細胞間的信號傳導(dǎo)，為宮頸癌的研究提供了一些依據(jù)。
　　4、設(shè)計了一種簡單的微流控芯片，實現(xiàn)了三種

8、物質(zhì)的快速混合，并將其用于VEGF165和可控適配體之間的動力學(xué)研究。其中，微流控芯片主要包含了三個不同功能的單元結(jié)構(gòu):(1)在混合區(qū)前端的三個進樣通道上各自加入一段蛇形通道，用于減少進樣帶來的壓力和流速的偏差。(2)為了加快VEGF165、可控配體以及銥復(fù)合物熒光探針的快速混合，再設(shè)計一段40微米寬的混合區(qū)域。(3)在混合區(qū)域后面再加一段長的蛇形通道，這樣不僅能夠使三種物質(zhì)完全混合，還可以通過選擇不同的位置來觀察VEGF165與可控配

9、體之間的動力學(xué)變化情況。通過構(gòu)建對G-四鏈體結(jié)構(gòu)有高選擇性的銥復(fù)合物熒光探針，設(shè)計和組裝VEGF165適配體和G-四鏈體的可控配體，實現(xiàn)了VEGF165與可控配體之間動力學(xué)的研究，并用于細胞代謝物中VEGF165的分析檢測。最后，將所建立的方法用于研究在紫杉醇刺激下，宮頸癌細胞CaSki中VEGF165的含量變化，為宮頸癌的機理研究和藥物作用研究提供依據(jù)。
　　5、在分析檢測中，雖然蛋白質(zhì)的檢測以及藥物的檢測都有單獨相應(yīng)的檢測方法

10、，但是目前還沒有相應(yīng)的檢測方法或者平臺能同時實現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測和藥物的代謝檢測。本課題以VEGF165、PDGF-BB以及凝血酶為檢測目標物，將紫杉醇作用于共培養(yǎng)下的宮頸癌和內(nèi)皮細胞，進而考察它們的相關(guān)代謝物。為了實現(xiàn)高選擇性分析以及特異性捕獲，我們利用核酸適配體進行目標物的捕獲和檢測。同時利用滾環(huán)擴增技術(shù)(RCA)和G-四鏈體DNAzyme來提高分析的靈敏度。在分析的平臺上集成了質(zhì)譜和熒光顯微鏡，不僅可以實現(xiàn)代謝物的分析，還可以對細胞的